《Journal of Biological Chemistry》：Substrate and target selectivity of 4′-fluoroadenosine against viral and host polymerases
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开发针对新发RNA病毒的安全有效治疗药物是大流行防范工作的重要目标。4'-氟代尿苷（4'-FlU）是一种广谱抗病毒药物，已被证明可抑制病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。鉴于其显著的抗病毒活性范围，这类核苷类似物值得进一步研究。本研究中，研究人员探讨了4
开发针对新发RNA病毒的安全有效治疗药物是大流行防范工作的重要目标。4'-氟代尿苷（4'-FlU）是一种广谱抗病毒药物，已被证明可抑制病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。鉴于其显著的抗病毒活性范围，这类核苷类似物值得进一步研究。本研究中，研究人员探讨了4'-氟代腺苷（4'-FlA）的抗病毒活性及其抑制机制。与4'-FlU类似，4'-FlA对代表不同病毒家族的八种原型病毒表现出广谱抗病毒活性。酶动力学研究显示，其三磷酸形式（4'-FlA-TP）可被病毒RdRp有效掺入。研究人员解析了严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RdRp与双链RNA及掺入的单磷酸形式（4'-FlA-MP）复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构，表征了活性位点的相互作用。掺入的类似物在引物延伸反应中引发异质性抑制模式。相比之下，含有嵌入4'-FlA-MP的模板可抑制互补UTP在病毒RdRp中的掺入。然而，4'-FlA-TP的掺入并不局限于病毒聚合酶，同样包括人线粒体RNA聚合酶（h-mtRNAP）。这些结果证明了4'-氟代核苷作为抗病毒药物的广泛潜力，并指导开发更具选择性的衍生物以供医疗使用。
## 研究背景与问题
RNA病毒与人类疾病密切相关，具有引发疫情、流行病或大流行的潜力。SARS-CoV-2及COVID-19大流行即为典型案例，凸显了在疫情期间开发有效治疗手段的紧迫需求。病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）对病毒复制至关重要，是抗病毒药物开发的合理靶点。尽管不同病毒家族的RdRp结构特征各异，但其活性位点通常保守以容纳核苷三磷酸（NTPs），这为开发可用于快速应对新发病原体的广谱抗病毒药物提供了契机。
核苷和核苷酸类似物（NAs）模拟天然NTPs，一旦掺入新生RNA链即可抑制病毒RNA合成。瑞德西韦（RDV）是一种1'-氰基修饰的C-连接腺苷单磷酸前药，可干扰SARS-CoV-2 RdRp的RNA合成，已获批用于COVID-19治疗。RDV对冠状病毒科、小RNA病毒科、黄病毒科、丝状病毒科、副黏病毒科和肺病毒科等具有广谱抗病毒活性，但对分段负链病毒家族如内罗病毒属、沙粒病毒属和正黏病毒属（流感病毒）活性较低或无效。莫努匹韦作为胞苷类似物和β-D-N4-羟基胞苷（NHC）的前药，也展示了广泛的活性谱，包括多种分段负链RNA病毒。研究性药物4'-氟代尿苷（4'-FlU）具有类似活性谱。虽然莫努匹韦作为诱变核苷酸发挥作用，RDV和4'-FlU则抑制病毒RNA合成。
4'-FlU广谱活性的生化基础尚不明确。先前研究表明，其活性三磷酸形式4'-FlU-TP可被呼吸道合胞病毒（RSV）、SARS-CoV-2和甲型流感病毒（FluA）的病毒RdRp用作底物。对于RSV和FluA RdRp，天然对应物UTP约以4倍优势竞争过4'-FlU-TP。一旦掺入，4'-FlU对引物链延伸呈现异质性效应：针对RSV RdRp，在掺入位点"i"及更下游位置的抑制分别指向即时链终止和延迟链终止的贡献；对于SARS-CoV-2 RdRp，单次掺入4'-FlU仍可产生全长产物；而对于FluA RdRp，则存在即时链终止的证据。总体而言，4'-FlU的作用机制呈异质性，依赖于病毒RdRp的性质。
基于4'-FlU的研究提出了若干重要问题：4'-氟修饰是否在不同碱基背景下也能介导抗病毒效应？对病毒聚合酶的抑制特异性如何？是否存在针对不同聚合酶靶点的共同抑制机制？为解答这些问题，研究人员合成了4'-FlU的嘌呤衍生物4'-氟代腺苷（4'-FlA），并证明其抗病毒活性谱与4'-FlU相当。
## 主要关键技术方法
研究人员采用综合性的生化与结构生物学技术平台评估4'-FlA的抗病毒效力与选择性。在细胞水平，利用多种细胞系（HepG2、H1 HeLa、HeLa-ACE2、A549、MDCK、Vero-E6）对代表性病毒进行细胞基础抗病毒活性与细胞毒性测定；在酶学水平，采用纯化重组病毒RdRp复合物进行稳态动力学分析，测定Vmax和Km参数以计算底物选择性，并通过引物延伸实验和凝胶电泳分析抑制模式；在结构生物学方面，解析了SARS-CoV-2 RdRp与dsRNA及4'-FlA-MP复合物的冷冻电镜结构；此外，还对宿主聚合酶（h-mtRNAP、Pol γ、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段）进行了脱靶效应评估，并基于已知结构进行了4'-FlA-TP与h-mtRNAP复合物的分子建模研究。
## 研究结果
**4'-FlA的抗病毒活性与细胞毒性**
4'-FlA对多种原型病毒表现出抗病毒效应，按EC50值递增顺序为：登革热病毒2型（DENV-2，0.016 μM）> RSV（0.061 μM）> FluA（0.067 μM）> SARS-CoV-2（0.071 μM）> 克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV，0.076 μM）> 乙型流感病毒（FluB，<0.1 μM）> 人鼻病毒16型（HRV-16，0.14 μM）> 埃博拉病毒（EBOV，0.22 μM）。针对EBOV微型基因组，4'-FlA同样显示抗病毒活性（0.17 μM）。CC50值因细胞类型而异，范围为1.0至>50 μM，相应的选择性指数（SI）为约10至>100，表明观察到的抗病毒活性主要由聚合酶抑制驱动。与RDV的前药GS-441524相比，4'-FlA展示了更广泛的抗病毒活性谱，但较低的CC50值提示潜在脱靶效应。
**4'-FlA-TP被代表性病毒聚合酶掺入**
通过纯化重组聚合酶和聚合酶复合物比较ATP与4'-FlA-TP的掺入效率。对于DENV-2、HRV-16、SARS-CoV-2、RSV、EBOV、CCHFV和FluB，使用短模型引物/模板进行体外酶促RNA合成评估；FluA RdRp RNA合成活性则需使用基因组vRNA模板和放射性标记的13-nt 5'-甲基-7-鸟苷帽引物。稳态动力学参数Vmax和Km的测定显示，4'-FlA-TP掺入的相对效率顺序为：HRV-16（0.48）> SARS-CoV-2（0.99）> CCHFV（1.4）~ FluB（1.4）> EBOV（4.2）> RSV（7.1）> DENV-2（7.6）。使用13-nt帽引物系统，FluA和FluB的选择性值分别为1.5和0.52。CCHFV、FluA和FluB RdRp的低选择性值是4'-FlA-TP区别于RDV-TP的显著特征。这些数据表明4'-氟修饰在所有测试的病毒聚合酶中均被良好耐受，4'-FlA-TP可有效竞争天然核苷酸ATP。
**4'-FlA-TP在引物链中的异质性效应**
评估单次4'-FlA-TP掺入后的RNA合成模式：对于DENV-2 RdRp，4'-FlA-TP似乎不抑制引物延伸；对HRV-16和SARS-CoV-2 similarly无抑制效应。相反，4'-FlA-TP掺入对FluB和CCHFV RdRp引发即时链终止；对RSV RdRp在"i+3"位置产生下游抑制效应；允许第二次4'-FlA-TP掺入的模板增强该位置的抑制效应，EBOV中同样观察到此现象。使用13-nt放射性标记帽引物和vRNA模板，4'-FlA-TP掺入对两种流感病毒RdRp均导致即时链终止，同时在"i+2"位置可见第二抑制位点。值得注意的是，所有病毒RdRp在单次4'-FlA-TP掺入后仍能产生更长的RNA产物；如流感、RSV和EBOV RdRp所示，多次掺入导致的抑制更为完全。
通过测定AMP和4'-FlA-MP终止引物链后UTP在"i+1"位置掺入的动力学参数进行定量分析：对于正链RNA病毒，4'-FlA终止引物的延伸仅轻微受损（3-5倍）；对RSV和EBOV，4'-FlA终止引物显示13倍和8倍抑制；对CCHFV，4'-FlA-MP终止引物的UTP掺入受抑制约33倍；对FluB，4'-FlA-MP终止引物延伸需要UTP浓度显著增加710倍。因此，4'-FlA-TP对后续核苷酸掺入呈现可变抑制阉制，单次掺入的抑制效应呈异质性且不完全。
**嵌入4'-FlA残基的模板依赖性抑制**
为评估掺入4'-FlA-MP的模板作为模板碱基时的RNA合成影响，研究人员设计了在11位含有单AMP或4'-FlA-MP的RNA模板。所有病毒RdRp在低微摩尔浓度NTPs（1-10 μM）下均能在模板"A"上产生全长产物；而在模板"F"上，嵌入4'-FlA-MP前出现抑制位点，全长RNA相应减少。该抑制效应尽管随NTP浓度增加而有所缓解，但仍持续存在。进一步评估显示，UTP在嵌入4'-FlA-MP模板对面的掺入在所有NTPs中最有效，但相对于等效位置的AMP仍有所降低。因此，4'-FlA在模板中时可损害 incoming UTP的掺入，提供了解释4'-FlA广谱抗病毒活性的统一作用机制。
**SARS-CoV-2 RdRp掺入4'-FlA-MP的冷冻电镜结构**
研究人员以3.4 ?整体分辨率解析了SARS-CoV-2 RdRp复合物（含nsp12、nsp8和nsp7）与RNA及掺入4'-FlA-MP复合物的冷冻电镜结构。结构分析显示4'-FlA-MP占据+1或"i"活性位点位置，与之前描述的RDV在SARS-CoV-2 RdRp中的结合位点等效。在此位置，4'-FlA与模板链U10核苷酸形成碱基对。尽管由于局部分辨率有限无法明确界定4'-氟修饰的精确取向，但其定位于nsp12的S759和N691残基附近，这些残基也参与RDV-TP结合。与DENV-2 RdRp和FluB RdRp结构的比较表明，4'-FlA可能以类似姿态结合于各自活性位点，进一步突显了广谱活性的潜力。
结构中的RNA密度延伸至用于结构测定的20碱基对双链区域之外，表明发生了额外延伸。模板链悬垂尿嘧啶残基与4'-FlA之间的反应表明4'-FlA支持持续的引物延伸活性。与SARS-CoV-2中RDV因1'-氰基修饰与S861冲突而表现延迟链终止不同，4'-FlA在引物链中介导不同机制。结构建模显示，在引物链背景下，4'-氟原子位于C813主链原子和D865侧链的3 ?范围内；而当4'-氟修饰建模至模板链时，氟原子与G683、G590、S592的主链原子以及N543和F594的侧链距离在3 ?以内，提示这些位置发生空间冲突的可能性更高。这些观察表明，SARS-CoV-2 RdRp模板链中4'-氟修饰的存在可能干扰聚合酶活性。
**核苷酸类似物被宿主酶掺入**
研究人员检测了4'-FlA-TP作为h-mtRNAP底物的情况，并与已批准NAs进行比较。RDV-TP、NHC-TP和索非布韦（SOF）被纳入比较。RDV-TP掺入效率比ATP低2200倍，与先前报告一致；NHC-TP选择性为22；SOF-TP与h-mtRNAP的选择性无法测定。相比之下，4'-FlU-TP被h-mtRNAP非常有效地使用，选择性为4.1；4'-FlA-TP同样被h-mtRNAP有效掺入，选择性为8.4。基于h-mtRNAP转录起始复合物的现有冷冻电镜结构，研究人员生成了4'-FlA-TP在h-mtRNAP NTP结合位点（N位点）掺入的模型，4'-氟修饰良好适配于h-mtRNAP相邻分子表面，支持其作为底物的高效利用。
评估2'-脱氧-4'-FlA-TP（2'-d-4'-FlA-TP）对抗人DNA聚合酶γ（Pol γ）和大肠杆菌DNA聚合酶I（KF），以进一步评估潜在细胞毒性。针对Pol γ，ddATP被非常有效地掺入（选择性0.66），TFV-DP掺入效率则低210倍。研究发现Pol γ以0.94的选择性掺入2'-d-4'-FlA-TP，KF以比dATP低4.8倍的效率掺入2'-d-4'-FlA-TP。若4'-FlA-TP被核糖核苷酸还原酶（RNR）有效转化为2'-d-4'-FlA-TP，则存在掺入宿主DNA的潜力。
**宿主聚合酶抑制不明显**
尽管4'-FlA-TP和2'-d-4'-FlA-TP被人和细菌聚合酶有效掺入提示脱靶效应，但细胞RNA合成未必被抑制。评估显示，h-mtRNAP催化的RNA合成中，4'-FlA-TP在14位（"i"）掺入后引物链未见明显抑制效应；后续CTP掺入仅轻微降低1.8倍。4'-FlU-TP掺入同样未显示明显抑制。对Pol γ和KF，2'-d-4'-FlA-TP在引物延伸反应中未见可见抑制；而ddATP则作为即时链终止剂破坏DNA合成。
## 讨论与结论
4'-FlA展示了针对多种RNA病毒的广谱抗病毒活性，其效力通常不亚于甚至优于已批准NAs。该研究利用综合平台确定了活性4'-FlA-TP形式的生化属性。4'-FlA对DENV-2、SARS-CoV-2、HRV-16、RSV、CCHFV、FluA和FluB均显示有效抗病毒活性，相应聚合酶复合物对4'-FlA-TP的掺入速率高效，底物选择性测量表明该核苷酸类似物可有效竞争天然ATP池。然而，宿主酶的高效掺入提示脱靶效应：4'-FlA-TP和4'-FlU-TP均被h-mtRNAP掺入，2'-d-4'-FlA-TP被非病毒DNA聚合酶有效掺入，引发对靶点特异性的担忧。
引物延伸反应中的抑制模式依赖于病毒聚合酶的性质，与4'-FlU-TP的报告一致。4'-FlA-TP同样呈现异质性抑制模式，但模板依赖性抑制提供了跨病毒RdRp的统一机制。当嵌入模板链时，4'-FlA抑制互补UTP的掺入，类似机制也已报道于RDV。对于含有3'-羟基的化合物，尤其是链终止不完全时，需考虑此机制。1'-氰基和4'-氟修饰均能通过相同机制介导广谱抗病毒活性，这一发现可用于药物开发工作。两种化合物结构差异对掺入速率更敏感，可能降低了RDV对若干分段负链RNA病毒的抗病毒效应。
冷冻电镜结构为理解4'-氟修饰如何影响底物利用提供了指导，并深入揭示了4'-FlA-TP在引物链中的掺入和后续效应。当前特别需确定模板依赖性抑制的结构要求。结构建模提示该效应可能源于模板链中4'-氟修饰与周围残基更高的空间冲突可能性，但核苷酸掺入可能伴随静态建模无法捕捉的构象变化，凸显了进一步结构研究的必要性。尚不清楚此类机制是否影响宿主聚合酶；宿主聚合酶产生的修饰RNA的性质、数量和生物学相关性等复杂因素仍有待研究。
综上所述，4'-氟修饰提供了具有广谱抗病毒活性的有前景骨架，这归因于高效掺入和统一的模板依赖性抑制机制。然而，宿主聚合酶的底物利用引发担忧。4'-FlU和4'-FlA为设计具有额外修饰以提高病毒聚合酶靶点选择性的衍生物提供了可行起点。该研究的生化方法可指导和帮助降低此类工作的风险。随后应开展疗效和安全性研究，以确定潜在治疗获益的适宜医疗场景，特别是在高致病性病原体感染治疗中予以考虑。
