《Journal of Biological Chemistry》：Macrophage-specific targeting of histone demethylases with small-molecule inhibitors suppresses inflammatory response in vivo
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摘要：巨噬细胞是多功能免疫细胞，能够响应多种内源性和外源性信号，并在炎症表型和促修复表型之间转换。表观遗传过程的复杂网络，如DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化，在调节巨噬细胞极化和炎症基因表达中起关键作用。对呼吸衰竭、长程COVID-19（新型冠状病毒感染后综
摘要：巨噬细胞是多功能免疫细胞，能够响应多种内源性和外源性信号，并在炎症表型和促修复表型之间转换。表观遗传过程的复杂网络，如DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化，在调节巨噬细胞极化和炎症基因表达中起关键作用。对呼吸衰竭、长程COVID-19（新型冠状病毒感染后综合征）和流感患者的转录分析显示，肺巨噬细胞中染色质修饰因子（包括广泛定义为赖氨酸去甲基化酶（KDMs）的组蛋白去甲基化酶）的表达增强。因此，在体内对巨噬细胞特异性进行这些酶的药理学扰动在减轻炎症方面具有治疗前景。为研究KDMs在炎症中的作用，研究人员筛选了一组染色质修饰剂的小分子抑制剂，以评估其在体外诱导抗炎巨噬细胞极化的功效。研究表明，用广谱KDM抑制剂n-辛基-IOX1和KDM5特异性抑制剂PB-IT预处理，可显著降低脂多糖（LPS）诱导的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中炎症基因Il1b、Il6、Tnfa和iNos的表达。随后的RNA测序和CUT&RUN（切割靶标与核酸酶释放）分析显示，LPS激活导致独特的转录组学和表观基因组学改变，包括主转录因子（TFs）BLIMP-1和GFI1的表达，而n-辛基-IOX1和PB-IT处理则重塑了这些调控网络，从而阻碍了炎症基因的表达和反应。为了进一步探究KDM抑制在扰动巨噬细胞介导的体内炎症中的价值，研究人员使用细胞特异性靶向脂质纳米颗粒将n-辛基-IOX1选择性递送至小鼠巨噬细胞。包裹n-辛基-IOX1的纳米颗粒显著减少了LPS介导的腹膜巨噬细胞扩增和该细胞群中的炎症基因表达，突显了在炎症性疾病中用小分子抑制剂对KDMs进行巨噬细胞特异性靶向的重要性。
**论文解读**
**研究背景与意义**
巨噬细胞作为先天免疫系统的重要组成部分，在炎症反应、组织修复和稳态维持中扮演关键角色。其功能多样性源于表型可塑性，即内在和外在信号调节静息巨噬细胞分化为特定状态，这一过程通常称为巨噬细胞极化。经典激活的促炎巨噬细胞和替代激活的修复性巨噬细胞是极化分类的简化描述。表观遗传修饰及其相关酶被认为是巨噬细胞表型可塑性和极化的关键贡献因素。其中，含有Jumonji C（JmjC）催化结构域的赖氨酸去甲基化酶（KDMs）通过去除炎症基因位点的抑制性组蛋白甲基化标记（“表观遗传刹车”）来调控炎症反应。尽管研究表明某些表观遗传修饰因子对巨噬细胞介导的炎症至关重要，但尚未在体内实现对巨噬细胞特异性表观遗传修饰因子的靶向调控以调节这一关键炎症细胞亚群的功能。此外，对呼吸衰竭、长程COVID-19和流感患者的分析显示，肺巨噬细胞中KDMs的表达增强，提示其在炎症性疾病中可能发挥重要作用。因此，阐明KDMs在巨噬细胞炎症极化中的作用，并开发靶向干预策略，对于理解炎症机制和开发新疗法具有重要意义。本研究旨在探究KDM抑制在巨噬细胞炎症中的作用，并评估小分子抑制剂在体内外模型中的疗效，相关成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
**关键技术方法**
研究人员主要运用了以下关键技术：1. **化学筛选与体外模型**：使用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM），预处理一组针对染色质修饰剂（包括KDMs）的小分子抑制剂，随后用LPS刺激，通过qPCR（定量聚合酶链反应）和ELISA（酶联免疫吸附测定）评估炎症基因和细胞因子表达。2. **转录组与表观基因组分析**：对处理后的BMDM进行RNA测序（RNA-seq）以分析全转录组变化，并采用CUT&RUN（切割靶标与核酸酶释放）技术检测组蛋白修饰H3K4me3（激活标记）和H3K9me3（抑制标记）的变化。3. **体内模型与靶向递送**：使用C57BL/6小鼠，通过腹腔注射进行全身性或靶向性给药。靶向递送采用巨噬细胞特异性脂质纳米颗粒（LNPs）封装n-辛基-IOX1，并通过流式细胞术分析腹膜灌洗液、血液、骨髓和脾脏中的白细胞亚群频率，以及分选细胞进行基因表达分析。4. **生物信息学分析**：利用公共单细胞转录组数据库（如Broad研究所单细胞数据库）分析感染背景下巨噬细胞中KDM的表达谱；对RNA-seq和CUT&RUN数据进行差异表达基因、通路富集和基序分析。
**研究结果**
**1. JmjC KDMs介导巨噬细胞的促炎反应**
对公共单细胞转录组数据的分析显示，在呼吸衰竭、长程COVID-19患者的肺泡巨噬细胞、脓毒症患者的循环单核细胞以及流感病毒感染的小鼠肺巨噬细胞中，多种KDM亚型（如KDM2A、KDM3A-B、KDM4A-B、KDM5B、KDM5D）的表达上调。化学筛选表明，在BMDM中，广谱KDM抑制剂n-辛基-IOX1和KDM5特异性抑制剂PB-IT预处理能显著降低LPS诱导的炎症基因（Il1b、Il6、Tnfa、Nlrp3）表达和TNF-α与IL-6的蛋白分泌，而其他KDM抑制剂（如针对KDM4、KDM5/6、TET或FTO的抑制剂）效果较差。n-辛基-IOX1还增加了抗炎巨噬细胞标记物Arg1的表达，并下调了与炎症巨噬细胞极化相关的Ccl5和Ccl7。
**2. KDM抑制剂抑制LPS刺激巨噬细胞中的全转录组炎症通路**
RNA-seq分析表明，LPS处理上调了巨噬细胞中多个炎症网络（如干扰素γ反应、干扰素α反应、IL-6-JAK/STAT信号、TNF-α信号）。n-辛基-IOX1或PB-IT预处理显著抑制了这些全转录组范围的炎症反应。两种抑制剂共同下调的通路包括IL2-STAT5信号、同种异体移植排斥、炎症反应通路、干扰素γ和α反应。研究人员鉴定出14个共同差异表达基因，包括炎症趋化因子Cxcl10、干扰素反应基因Ifit1bl1和糖酵调节因子Slc2a6。
**3. n-辛基-IOX1重塑巨噬细胞中LPS诱导的表观遗传改变**
CUT&RUN分析显示，LPS处理改变了H3K4me3和H3K9me3的峰值分布。n-辛基-IOX1（而非PB-IT）处理使峰值分布恢复到类似对照组的状态。在H3K4me3标记中，n-辛基-IOX1和对照组相比LPS组共同富集了8个重叠基序，包括FOSL2:JUND、PRDM1和NHLH1，这些已知对抑制巨噬细胞介导的炎症至关重要。在H3K9me3标记中，鉴定出6个共同富集基序，涉及MEIS1、MEIS3、MYB、NKX2.3、Hic1和TBX4等基因。这表明n-辛基-IOX1逆转了LPS在巨噬细胞中引起的表观遗传改变。
**4. n-辛基-IOX1在体内抑制对LPS的炎症反应**
全身性给予n-辛基-IOX1的小鼠，在LPS刺激后，腹膜灌洗液中巨噬细胞频率降低，单核细胞比例增加，分选的腹膜巨噬细胞中Il6和Nlrp3的表达显著减弱。流式细胞术分析显示，外周血中单核细胞和Ly-6C
high单核细胞频率在24小时降低，但48小时后此降低消失。
**5. 巨噬细胞特异性递送n-辛基-IOX1限制体内炎症基因表达**
采用脂质纳米颗粒（LNPs）进行巨噬细胞特异性递送。装载n-辛基-IOX1的LNPs被巨噬细胞特异性摄取。与空载LNPs对照组相比，n-辛基-IOX1 LNP处理组小鼠腹膜巨噬细胞频率和巨噬细胞/单核细胞比率降低，T细胞频率升高。在分选的腹膜巨噬细胞中，炎症基因Il1b和iNos表达下调，Tnfa有非显著下降。有趣的是，在雌性动物中，n-辛基-IOX1 LNP处理降低了腹膜巨噬细胞中多个JmjC KDM亚型（如Kdm5b、Kdm6a）的表达，但在雄性动物中未观察到Kdm5d和Kdm6c的显著变化，提示存在性别依赖性调控。在其他细胞类型（如单核细胞、中性粒细胞、B细胞）中未观察到炎症基因下调，证实了n-辛基-IOX1 LNPs的细胞靶向效应。
**讨论与结论**
先天免疫记忆和训练免疫主要由表观遗传印记机制介导。组蛋白去甲基化异常破坏基因调控机制与炎症性疾病的发病机制有关。KDMs因其能够去甲基化激活性和抑制性组蛋白标记，在多种免疫细胞类型的炎症反应中发挥重要作用。本研究评估了KDM小分子抑制剂在体外和体内抑制巨噬细胞炎症反应的效果。预处理n-辛基-IOX1和PB-IT抑制了原代巨噬细胞对LPS的炎症反应。广谱KDM抑制剂n-辛基-IOX1下调了炎症通路，重塑了基因调控网络，使巨噬细胞的炎症基因表达特征和表观遗传状态恢复至类似对照状态。此外，研究采用新型LNP介导的巨噬细胞特异性递送策略，在体内实现了n-辛基-IOX1的靶向递送，证明该策略能减少炎症巨噬细胞数量并减轻LPS注射小鼠的炎性细胞因子产生。这种靶向递送KDM激动剂/拮抗剂的方法具有巨大的治疗潜力，可减少脱靶效应和不良反应。CUT&RUN分析的一个显著发现是，n-辛基-IOX1同时重塑了激活性和抑制性组蛋白甲基化标记，这可能是泛JmjC KDM抑制的结果。研究也指出了若干局限性，例如n-辛基-IOX1也竞争性抑制其他2-氧戊二酸依赖的双加氧酶家族成员；观察到n-辛基-IOX1对巨噬细胞炎症的性别依赖性影响；以及需要进一步研究特定KDM在脓毒症等疾病背景下的功能。
**结论**：研究表明，含有JmjC结构域的KDMs在炎症性巨噬细胞极化中起关键作用。小分子抑制剂n-辛基-IOX1和PB-IT能有效抑制巨噬细胞介导的炎症反应。通过脂质纳米颗粒实现巨噬细胞特异性靶向递送n-辛基-IOX1，能在体内减轻炎症反应，且效果具有细胞特异性。这些发现揭示了靶向巨噬细胞表观遗传修饰因子（如KDMs）在缓解炎症方面的治疗潜力。
