患者特异性肿瘤微环境中血管异质性的高通量数字解码

《Advanced Healthcare Materials》：High-Throughput Digital Decoding of Vascular Heterogeneity in Patient-Specific Tumor Microenvironments

　　

在复杂微生理系统（Microphysiological Systems，MPS）中，尤其是在患者来源肿瘤微环境内，对血管异质性进行定量表征，仍然是实现可扩展疾病建模与治疗评估的一项重大挑战。现有分析方法主要依赖基于血管丰度的形态计量学（morphometrics）指标，且往往无法解析异质性血管系统中的网络连通性及空间重塑。本文提出iMAP平台，这是一种高通量数字血管分析框架，集成了注塑成型微流控芯片与交互式图像分析工具（iMAP Analyzer）。该平台可实现拓扑解析且具区域感知能力的血管结构定量，能够捕获血管形态、分支复杂度、连通性，以及肿瘤近端与远端区域之间的空间变异。将该平台应用于患者来源胃癌肿瘤球与供体匹配的iPSC来源内皮细胞（iPSC-ECs）或原代HUVECs的3D共培养体系后，iMAP在标准化条件下识别出网络组织和空间稳定性方面的差异，其中iPSC来源网络表现出更高的碎裂化和更明显的外周不稳定性。这些发现表明，连通性归一化且区域解析的分析可提供超越传统整图指标的关键见解。iMAP框架为复杂MPS中的定量血管表型分析提供了一种可扩展且标准化的方法，支持高内涵分析，并推动血管化体外疾病模型的发展。

该论文发表于《Advanced Healthcare Materials》，核心目标是针对患者来源肿瘤微环境中血管网络定量分析不足的问题，建立一种兼具高通量、标准化、拓扑解析与区域感知能力的数字化分析平台。研究背景在于，血管结构不仅决定营养输送、免疫细胞迁移和药物运输效率，也是组织功能与治疗反应的重要结构基础。近年来，微生理系统（MPS）和器官芯片技术已能在体外构建具灌注潜力的血管网络，并进一步结合患者来源细胞用于疾病建模和药物评估。然而，现有分析策略多集中于血管面积、密度、总长度等“丰度型”指标，难以区分连续成熟网络与碎裂不稳定网络，也无法充分揭示肿瘤邻近与远离区域之间的空间重塑差异。因此，在复杂、异质性强的患者来源模型中，迫切需要一种能够量化网络连通性、稳定性以及区域特异性形态变化的分析框架。

为解决上述问题，研究人员开发了iMAP平台。该平台由两部分组成：一是兼容96孔格式的注塑成型微流控装置iMAP Chip，用于高通量构建血管化肿瘤微环境；二是图形用户界面（GUI）驱动的iMAP Analyzer，用于对共聚焦图像进行交互式预处理、分割、骨架化、拓扑分析和区域化定量。与传统整图汇总分析不同，iMAP不仅提取血管面积、密度、长度、厚度等常规形态学指标，还提取节点数、连通性、网孔数等拓扑参数，并进一步引入连通性归一化复杂度指标、加权厚度均一性（Weighted Thickness Uniformity，WTU）、最大网孔分数（Largest Mesh Fraction，LMF）和连通网孔整体参数（Connected Mesh Overall Parameter，CMOP）等综合指标，从而对网络完整性和成熟度进行更精确评估。研究显示，该平台能够在相同实验条件下区分不同内皮来源形成的血管表型差异，并揭示传统指标难以发现的空间异质性。

主要技术方法概括如下：研究采用三星医疗中心来源的健康志愿者与晚期胃癌患者外周血单个核细胞（PBMCs）建立iPSCs，并分化获得iPSC来源内皮细胞（iPSC-ECs）及成纤维细胞；以患者腹水来源肿瘤细胞构建肿瘤球；在iMAP Chip中将肿瘤球、内皮细胞和基质支持细胞进行3D共培养；使用高内涵共聚焦显微成像获取z-stack图像，并转换为最大强度投影；通过iMAP Analyzer完成阈值分割、骨架化、连通域分析、ROI定义、肿瘤中心化分区及多参数定量；最后结合主成分分析（PCA）及统计学比较评估不同内皮来源和不同空间区域的血管表型差异。

2.1 Workflow for ROI-Resolved Quantitative Phenotyping of Vascularized Tumor Microenvironments
本节建立了整篇研究的分析框架。研究人员首先说明iMAP Chip能够稳定支持由iPSC-EC或HUVEC、基质细胞及肿瘤球构成的3D血管化肿瘤共培养体系。随后通过高内涵共聚焦成像采集多通道z-stack数据，并由iMAP Analyzer执行预处理和ROI定义。通过这一流程，研究获得了包括覆盖率、血管面积、密度、总长度、厚度均值±标准差，以及节点数、连通指数、网孔数在内的一整套特征。该部分得出的结论是：iMAP建立了一个适用于后续表型分析和空间异质性分析的标准化特征空间。

2.2 Interactive Software for Digital Vascular Profiling of 3D Networks
本节聚焦软件工具本身。研究人员开发了iMAP Analyzer，用于支持用户引导下的血管形态定量，并将软件输出与人工专家标注结果进行比较。结果显示，软件在关键形态学指标上与人工分析高度一致，且无统计学显著差异。这说明该软件能够可靠地完成血管图像分割与定量。其四阶段工作流包括Setup、Preprocessing、Interactive Adjustment和Automated Quantification，通过实时滑块调节阈值、目标尺寸过滤和Gaussian smoothing等参数，实现对复杂患者来源样本的稳健处理。

2.3 Adaptive Segmentation Enables Image-Specific Vascular Quantification
本节说明交互式分割模块如何解决患者来源样本中信号强度不均、背景杂质和形态差异造成的分析困难。研究人员在iMAP Analyzer中加入图像特异性参数优化，随后执行二值化、骨架化、基于连通性的组分分析和定量特征提取。结果表明，该流程可有效去除非血管碎片、补偿背景不均，同时保留较弱的真实血管信号，从而减少假阳性和真信号丢失。由此得出的结论是：用户引导式预处理结合自动特征提取，可在异质性样本和不同成像条件下实现可重复的血管定量。

2.4 Modeling Spatial Tumor–Vascular Interactions Using Patient-Derived iPSC-ECs
本节展示iMAP平台在患者来源肿瘤血管模型中的应用。研究人员将患者来源iPSC系分化为ECs，并结合匹配的成纤维细胞及患者来源胃癌肿瘤球，在iMAP Chip中构建供体特异性肿瘤—血管共培养模型；同时以原代HUVEC和肺成纤维细胞为标准对照。共聚焦结果显示，肿瘤球可稳定诱导邻近血管芽生长，但不同内皮来源形成的网络形态明显不同：HUVEC形成致密、腔化且高度互联的结构，而iPSC-EC形成的网络更碎裂、分支较少、环路不连续。该节结论是：iMAP平台可在临床相关MPS中实现拓扑与区域双重解析的血管表型分析。

2.5 Endothelial Source-associated Differences in Vascular Morphogenesis
本节比较内皮来源与血管形态发生之间的关系。在相同肿瘤球共培养条件下，iPSC-EC网络表现为管径不规则、分支不完整和频繁碎裂，而HUVEC网络更连续、互联性更强。研究人员通过CMOP等综合评分指标对两组进行客观区分，并发现iPSC-EC网络具有更多非连通碎片、更高的碎片/网络比值以及更大的碎片尺寸分布变异。进一步分析WTU和LMF后发现，HUVEC网络具有更高的管腔厚度均一性和更大的优势网孔比例，而iPSC-EC网络则表现为较低WTU和碎裂化网孔模式。本节结论是：iMAP能够在标准化条件下清晰解析内皮来源相关的血管结构差异，尤其是传统方法常忽视的网络不稳定性。

2.6 Topological Phenotyping of Vascular Network Integrity
本节强调拓扑指标优于传统整体形态指标。研究人员发现，总血管长度和密度等常规描述符在HUVEC与iPSC-EC两组之间并无显著差异，说明单纯依赖丰度型指标不足以识别结构不稳定性。随后，研究采用每连通组分终点数（Endpoints per Connectivity）、每连通组分节点数（Nodes per Connectivity）和每连通组分网孔数（Meshes per Connectivity）三项连通性归一化复杂度指标进行分析。结果显示，iPSC-EC网络具有更高终末碎裂特征和更少网孔形成，而HUVEC网络具更高分支复杂度和互联程度。三项指标均显示显著组间差异，且在三维特征空间中两组可清晰分离。该节结论是：基于连通性归一化的拓扑分析能更灵敏、可重复地区分不同血管网络完整性状态。

2.7 Region-Aware Quantification of Spatial Heterogeneity in Patient-derived Tumor–Vascular Models
本节聚焦空间异质性。研究人员在供体匹配的iPSC-EC与肿瘤球共培养模型中观察到，同一样本内部血管结构存在显著空间差异：肿瘤邻近区域血管更致密且呈放射状排列，远离肿瘤区域则更分散、协调性更差。为实现标准化比较，研究引入肿瘤中心化分割策略，将图像划分为中央肿瘤邻近区和外周肿瘤远端区，并在iMAP Analyzer中实现GUI辅助操作。分析结果表明，iPSC-EC共培养中肿瘤邻近区表现为更高血管密度与径向组织，而外周区则连通性下降、结构离散性增强。该节结论是：区域感知分析能有效揭示肿瘤来源信号驱动的空间分级血管反应。

2.8 Region-Dependent Divergence in Vascular Architecture by Endothelial Source
本节进一步比较不同内皮来源在空间维度上的差异。研究人员发现，HUVEC条件下中央区和外周区均维持凝聚且互联良好的血管网络；相比之下，iPSC-EC表现出明显空间二分性，即中央区仍可形成致密互联网络，而外周区则呈现碎裂、紊乱和形态不稳定。定量上，两类细胞在肿瘤邻近区均具有较高血管密度和平均厚度，但“优势比”（dominance ratio，即最大连续血管组分占总血管面积比例）最具判别力：HUVEC在两个区域中均保持>90%的高优势比，而iPSC-EC在中央区相近、在外周区则降至<20%。这表明iPSC-EC网络在外周区域存在明显结构解体。本节结论是：iMAP可在同一样本内识别区域特异性血管表型，并量化不同内皮背景对肿瘤相关血管组织模式的影响。

讨论部分指出，本研究的主要创新在于将血管分析从“生长量化”转向“拓扑完整性量化”。iMAP通过交互式分割调参、连通性归一化指标以及肿瘤中心化区域分区，解决了复杂患者来源MPS中血管异质性难以稳定定量的关键问题。研究显示，HUVEC作为较稳定的参考内皮来源，在不同区域均形成较完整网络；而供体匹配iPSC-EC虽然更具患者特异性和转化相关性，但在相同培养条件下呈现更强的空间异质性和更明显的外周碎裂。论文同时强调，这些现象应理解为特定培养环境下的情境依赖性反应，而非单纯归因于细胞固有属性。研究还指出，iMAP已在外部基准数据集中验证了适用性，但当前仍局限于胃癌肿瘤球模型、最大强度投影分析及交互式而非全自动分割，后续可进一步拓展到更多疾病模型、全三维重建和机器学习整合。

研究结论部分可译为：本研究建立了iMAP平台，这是一种将96孔注塑成型MPS（iMAP Chip）与iMAP Analyzer相结合、用于拓扑解析血管表型分析的可扩展框架。通过带有实时叠加验证的交互式图形用户界面（GUI），该分析器能够实现可重复的图像分割以及形态计量、连通性和空间描述符的定量提取，从而支持对异质性患者来源血管网络进行高内涵分析。将其应用于肿瘤球—内皮细胞共培养模型时，iMAP在标准化实验条件下捕获了血管完整性和区域特异性重塑模式的显著差异，包括iPSC-EC来源网络中的碎裂化和空间不稳定性，而这些特征难以通过传统整图形态计量分析加以解析。通过引入连通性归一化指标与多变量表型映射，该平台为复杂微环境中血管结构的队列规模比较提供了标准化数字框架。尽管本研究聚焦于胃癌肿瘤球模型和基于共聚焦成像的终点分析，未来工作将把iMAP扩展至多种血管化疾病场景，并将形态计量输出与功能读数及基于机器学习的预测建模相整合。总体而言，iMAP平台将MPS中的复杂血管成像数据转化为可重复的数字表型，为精准肿瘤学提供定量基础，并推动患者特异性血管数字孪生表征的发展。