Gardiquimod脂质纳米乳(Gardiquimod Nanoemulsion, GDQM-NE)靶向皮肤利什曼病(Cutaneous Leishmaniasis, CL)皮损以减少系统性毒性及寄生虫负荷

《Advanced Healthcare Materials》：Gardiquimod Nanoemulsion Targets Cutaneous Leishmaniasis Lesions Reducing Systemic Toxicity and Parasite Burden

　　

摘要：皮肤利什曼病（Cutaneous Leishmaniasis, CL）难以治愈的原因在于利什曼原虫（Leishmania）寄生于真皮巨噬细胞内部并抑制其杀菌活性，导致慢性感染。Toll样受体（Toll-like Receptor, TLR）激动剂可恢复巨噬细胞的效应功能，但其治疗应用受限于系统性毒性。本研究开发了一种负载TLR7激动剂Gardiquimod（GDQM）的脂质基纳米乳（Nanoemulsion, NE），用于GDQM的系统性递送，以改善巨噬细胞靶向性并减少脱靶炎症效应。静脉给药后，GDQM-NEs高效富集于真皮皮损部位，与游离GDQM相比显著降低了系统性细胞因子释放，安全性得到改善。重要的是，纳米包封保留了GDQM的抗利什曼活性，使寄生虫负荷降低约2个对数级（~2-log reduction）。治疗诱导了Th1相关细胞因子（IFN-γ和IL-12p70）及调节性反应，包括IL-10产生和FoxP3+调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）扩增。尽管纳米粒在皮损处有效富集，但在引流淋巴结（Draining Lymph Node, dLN）的巨噬细胞检测到CD86上调，皮损局部巨噬细胞却未见此现象，表明局部巨噬细胞激活有限。这些发现表明GDQM-NEs有效克服了系统性给予TLR7激动剂所面临的主要递送及安全性障碍，而皮损微环境及TLR驱动的调节机制仍是限制治疗效果的关键制约因素。将TLR激动剂与抵消局部抑制通路的组合策略可能进一步提升CL的治疗效果。

论文解读：Gardiquimod Nanoemulsion Targets Cutaneous Leishmaniasis Lesions Reducing Systemic Toxicity and Parasite Burden

研究背景与立题依据

皮肤利什曼病（Cutaneous Leishmaniasis, CL）是由利什曼原虫（Leishmania）引起的被忽视热带病，原虫寄生于真皮巨噬细胞并诱导其向M2型极化从而逃避免疫清除。Toll样受体（Toll-like Receptor, TLR）7激动剂可通过激活NF-κB和IRF7（Interferon Regulatory Factor 7）信号通路促使巨噬细胞向M1型（经典活化巨噬细胞）极化并产生一氧化氮（Nitric Oxide, NO）及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）杀伤胞内原虫，但游离TLR7激动剂静脉给药会引发严重的全身性细胞因子释放综合征。既往研究显示纳米粒难以穿透至感染深部真皮，且系统性纳米载体能否真正与感染巨噬细胞共定位仍缺乏在体证据。因此，本研究旨在构建一种可静脉给药、能被动靶向富集于CL皮损感染巨噬细胞、同时屏蔽系统性毒性的GDQM负载脂质纳米乳（GDQM-loaded Nanoemulsion, GDQM-NE），评估其体外免疫代谢重编程及抗利什曼作用，并在小鼠CL耳部感染模型中明确其体内分布、安全性及治疗效能。该论文发表于《Advanced Healthcare Materials》。

主要关键技术方法

研究人员采用先前实验室优化的脂质纳米乳处方（含中链甘油三酯Suppocire CM、油酸Oleic Acid OA、PEG-40硬脂酸酯Myrj S40及大豆卵磷脂Lipoid S100），通过超声法制备空白NE及GDQM或亲脂荧光染料DiD负载NE，经离心纯化及表征（动态光散射Dynamic Light Scattering测定粒径/多分散指数Polydispersity Index PDI/ζ电位、UV-Vis测定包封率Encapsulation Efficiency EE及载药量Drug Loading DL、扫描电镜Scanning Electron Microscopy SEM观察形态、透析法考察体外释放及培养基中胶体稳定性）。分离培养BALB/c小鼠骨髓源性巨噬细胞（Bone Marrow-derived Macrophage, BMDM），用花生凝集素Peanut Agglutinin PNA法分选杜氏利什曼原虫大型利什曼原虫（Leishmania major）后鞭毛体并感染BMDM或小鼠耳部建立CL模型。体外实验通过MTT法测细胞毒性、流式细胞术Flow Cytometry检测DiD-NE摄取及表面标记（CD86/CD206）、RT-qPCR检测极化基因、Griess法测NO、MitoSOX测ROS、ELISA测细胞因子、Seahorse XF细胞线粒体压力测试及核磁共振Nuclear Magnetic Resonance NMR代谢组学分析、RT-qPCR定量寄生虫18S rRNA基因评估虫负荷。体内实验经尾静脉给予DiD-NE，IVIS Spectrum活体/离体荧光成像结合流式细胞术分析组织（耳、引流淋巴结draining Lymph Node dLN、肝、脾、肾）中NE与mCherry-L. major共定位及免疫细胞活化；每周静脉给药治疗5周，纵向监测耳部mCherry荧光（虫负荷）及卡尺测皮损肿胀，终点取耳及dLN做极限稀释培养Limiting Dilution Assay量化寄生虫、dLN细胞经可溶性利什曼抗原Soluble Leishmania Antigen SLA再刺激后ELISA测细胞因子、流式检测T细胞亚群（CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3），取血测早期血浆炎症因子（Cytometric Bead Array CBA），终点测血清生化指标及黑质区小胶质细胞Iba1免疫组化评估神经炎症。动物实验经纳瓦拉大学动物伦理委员会批准（协议123-21），符合欧盟指令2010/63/EU。

研究结果

3.1 Design and Characterization of GDQM-Loaded NEs

GDQM-NEs平均粒径约42.8 nm，PDI低，ζ电位约-6.9 mV，包封率约48.85%，载药量约1%（w/w），较同处方Imiquimod（IMQ）-NE显著提高；体外36 h累积释放约70%，在含10%胎牛血清Complete DMEM中2 h内无浊度增加证明胶体稳定；BMDM中IC₅₀约7.22 μM，与IMQ-NE相当；SEM显示为球形40–70 nm颗粒。

3.2 In Vitro Cellular Uptake and Intracellular Localization of DiD-Labeled NE by BMDM

DiD-NE在3 h内被未感染及L. major感染BMDM高效内化，感染不影响摄取效率；≥2 μg/mL DiD时近100%细胞DiD阳性，相对平均荧光强度（relative Mean Fluorescence Intensity, rMFI）随浓度升高而增加；激光共聚焦显示DiD信号与溶酶体追踪染料LysoTracker Green及mCherry-原虫共定位，证实NE被运送到含TLR7的内体/溶酶体区室。

3.3 GDQM-NEs Promote a Pro-Inflammatory Macrophage Phenotype at the Transcriptional and Surface Marker Levels in Both Non-Infected and Infected BMDM

1 μM GDQM-NE处理6 h后，BMDM中M1相关基因Nos2、Il12p40、Il6、Tnfa、Il1b及Irf7显著上调，M2相关Arg1、Cd206下调，M1/M2基因比值升高，接近IFN-γ+LPS（M1对照）水平；感染组趋势相同但略减弱；空白NE仅引起轻度M1基因诱导。48 h后流式检测显示GDQM-NE显著上调CD86（M1标记）、下调CD206（M2标记），此效应在联合IFN-γ时增强，在IL-4存在时CD206仍低于M2对照，说明可部分抵抗M2偏移；GDQM-NE还诱导Il10转录，空白NE无此作用。

3.4 GDQM-NEs Reinforce Macrophage Activation at the Functional Level: Cytokine, ROS, and NO Production

10 μM GDQM-NE处理48 h，上清TNF-α、IL-12p70显著升高（联合IFN-γ进一步放大），并诱导显著IL-10分泌；Griess法测NO释放显著增加（与M1对照相当）；MitoSOX流式检测显示ROS水平显著升高；上述功能分子在感染BMDM中略有降低但趋势保持一致；空白NE仅微弱诱导。

3.5 GDQM-NEs and Blank-NEs Drive a Robust Metabolic Reprogramming Toward Aerobic Glycolysis and Reduced Mitochondrial Respiration

Seahorse分析显示GDQM-NE使BMDM氧耗速率（Oxygen Consumption Rate, OCR）降低（最大呼吸及ATP偶联呼吸下降），细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR）升高，呈典型糖酵解表型（Warburg-like）；NMR代谢组学显示葡萄糖/果糖消耗增加、乳酸分泌增加、丙酮酸降低、谷氨酰胺消耗增加、丝氨酸及甲硫氨酸消耗增加伴甲酸盐释放增加，提示激活一碳代谢及表观遗传重编程支持M1极化；空白NE也引起部分代谢偏移但程度较弱。

3.6 GDQM-NEs Enhance Macrophage Anti-Leishmania Activity

L. major感染BMDM经10 μM GDQM-NE处理48 h，RT-qPCR定量原虫18S rRNA显示寄生虫负荷较未处理对照显著降低（与IFN-γ阳性对照相当），0.1及1 μM效果较弱；IL-4共刺激时降低趋势未达显著性；空白NE在任何浓度及共刺激条件下均无显著杀虫效果。

3.7 GDQM-NEs Achieve Co-Localization With L. major in Ears and Sustain Activation of Antigen-Presenting Cells in dLNs

建立L. major-mCherry耳感染模型后尾静脉注射DiD-GDQM-NE，IVIS离体成像显示NE在感染耳部选择性富集（单位面积荧光强于肝外其他器官），与mCherry信号重叠；流式显示耳部巨噬细胞、树突状细胞Dendritic Cell DC及中性粒细胞高效摄取NE并与mCherry⁺细胞双阳性（巨噬细胞最高）；但耳部浸润免疫细胞未见CD86明显上调。引流耳淋巴结（Auricular dLN）中B细胞、髓系抗原提呈细胞及浆细胞样树突状细胞（Plasmacytoid Dendritic Cell, pDC）也摄取NE，且CD86表达于24 h达峰值，表明dLN APC被激活而皮损局部巨噬细胞未被有效活化。

3.8 Nanoencapsulation Limits Early Systemic Inflammation Induced by GDQM

静脉给予游离GDQM（1.5 mg/kg）1 h及4 h后血浆TNF-α、IL-6、MCP-1及IFN-α急剧升高；同等剂量GDQM-NE组各因子仅轻微波动，与未处理对照组无显著差异；空白NE无诱导作用，证明纳米包封有效屏蔽急性期全身细胞因子风暴。

3.9 GDQM Treatment Drives Parasite Control Accompanied by Concurrent Effector and Regulatory Immune Responses

每周静脉治疗（0.5或1.5 mg/kg GDQM或GDQM-NE，共5周），仅高剂量（1.5 mg/kg）游离GDQM及GDQM-NE组显著延迟皮损mCherry荧光扩展，终点极限稀释法显示耳部寄生虫负荷降低约2-log，空白NE无影响；仅高剂量游离GDQM组卡尺测量耳厚度略有减小。dLN分析显示高低剂量GDQM及GDQM-NE均上调CD86⁺抗原提呈细胞比例，高剂量组dLN中Ifna及Irf7上调，SLA再刺激后IFN-γ、IL-12p70、TNF-α及IFN-α升高，同时IL-10升高且FoxP3⁺CD25⁺Treg频率增加，呈现效应与调节并存的免疫谱。

3.10 Encapsulation Mitigates Systemic and Neuroinflammatory Toxicity Effects Associated With Repeated GDQM Administration

重复给药后高剂量游离GDQM组血清AST、ALP及尿素显著升高，体重略降，出现转圈及运动协调障碍，黑质Iba1⁺小胶质细胞增多提示神经炎症；GDQM-NE各剂量组血清生化指标均在正常范围，无行为异常，Iba1染色与对照组相当，证实纳米包封减轻反复给药相关的肝/肾应激及神经毒性。

讨论与结论总结

讨论指出GDQM-NE通过静脉给药实现与原虫感染巨噬细胞的在体共定位并保留抗利什曼活性，纳米包封将GDQM的系统性毒性（细胞因子风暴、肝肾功能指标异常、小胶质细胞活化致神经炎症）降至可接受范围，这是其主要优势。然而，尽管NE在皮损富集并被巨噬细胞内化，皮损局部未检测到CD86上调（不同于dLN），提示已建立CL皮损的微环境具免疫抑制性（M2偏向、IL-10及Treg、局部代谢与pH因素）限制TLR7介导的巨噬细胞完全活化，这是疗效未能超越游离药的主因。体内外均观察到TLR7激活伴随IL-10上调及Treg扩增的负反馈调节，高剂量方实现显著寄生虫清除说明需Th1偏倚压倒调节反应。作者认为单纯提高GDQM-NE剂量或改进载体不足以克服局部抑制，未来应与免疫检查点抑制剂、常规抗利什曼药或特异性抗原联用以打破抑制微环境。空白NE本身具弱免疫代谢激活但无杀虫效价，提示载体脂质具一定免疫调节潜能可供后续优化。

结论（翻译）：本研究全面评估了GDQM负载NE对巨噬细胞从转录、效应功能到代谢重编程的整体促炎（M1）效应。GDQM-NEs能有效到达皮肤深层感染巨噬细胞并与利什曼原虫共定位，解决了CL中靶向递送至感染生态位这一主要难题。重要的是，纳米包封在实现此靶向富集的同时显著降低系统性暴露并限制炎症相关毒性，改善免疫刺激剂总体安全性。尽管安全性提升且递送有效，体内治疗效果仍仅为部分——寄生虫负荷降低2-log但未明显改善皮损转归——强调正确的生物分布及巨噬细胞靶向本身不足克服已建立皮损复杂的免疫学限制。最终，局部免疫景观决定治疗结局，干预时机、给药途径及合理的联合策略可能是充分挖掘TLR为基础免疫调节治疗潜力的必要条件。综上，本研究表明GDQM-NE平台是兼具安全性与靶向性的免疫调节剂递送系统，在需平衡靶向免疫激活与系统性毒性的广泛领域具应用前景。