《Journal of Clinical Virology》：Whole genome sequencing of hepatitis C virus from dried blood spots by hybrid capture for genotype and antiviral resistance determination
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Catherine Phillips|Benjamin Brown|Nicholas Machin|David F Bibby|Jean L Mbisa|Emma Ann DaviesUKHSA曼彻斯特病毒学实验室，曼彻斯特医学微生物学合作组织，曼彻斯特皇家医院，牛津路，曼彻斯特
Catherine Phillips|Benjamin Brown|Nicholas Machin|David F Bibby|Jean L Mbisa|Emma Ann Davies
UKHSA曼彻斯特病毒学实验室，曼彻斯特医学微生物学合作组织，曼彻斯特皇家医院，牛津路，曼彻斯特，M13 9WL
摘要
背景
干血斑检测可用于对难以接触的患者群体进行丙型肝炎病毒检测，但通常无法提供完整的基因型及药物耐药性信息。本研究评估了一种市售的混合捕获全基因组测序技术在干血斑样本中检测丙型肝炎病毒的应用效果，以判断其是否适用于临床诊断和监测。
方法
我们使用QIAGEN QIAseq xHYB HepC检测面板分析了147份干血斑样本和24份已知含有丙型肝炎病毒RNA的血浆样本。通过自行设计的迭代生物信息学流程生成全基因组序列。我们通过分析测序深度、基因分型准确性、耐药相关突变检测情况以及分析灵敏度来评估该检测面板的性能。
结果
无论是干血斑样本还是血浆样本，全基因组测序的成功率都很高，分别为95%和96%。不同主要基因型的基因组富集程度较为均匀，没有出现系统性缺失现象。基因分型结果与参考实验室的结果完全一致，包括针对新型1型亚型的检测。在所检测的样本中，27%存在耐药相关突变，而这些样本的耐药情况与参考实验室的结果也完全相符。全基因组测序的分析灵敏度低于7301 IU/ml，而单独检测NS5a基因时的性能则稍差一些。
结论
该检测方案能够从干血斑样本中可靠地生成高质量的全基因组序列，从而实现准确的基因型、亚型及耐药性分析。这种方法克服了在难以接触的人群中进行静脉采样的局限性，有助于推动分散式诊断的发展，同时也能提升那些传统医疗体系覆盖不足的群体的基因组监测水平。
引言
丙型肝炎病毒仍然是一个重大的健康问题。世界卫生组织估计有5000万人长期感染该病毒，其中很多人并不知道自己的感染状况[1]。丙型肝炎病毒可引发慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌[2]。虽然直接作用抗病毒药物的治疗成功率超过95%，但由于诊断和治疗方面的种种障碍，这些药物的实际应用效果仍受到限制[3]、[4]、[5]。世界卫生组织的目标是到2030年消除丙型肝炎，具体目标是新感染病例减少90%，死亡人数减少65%。要实现这一目标，就需要更完善的诊断方法以及更广泛的治疗途径，尤其是针对注射毒品者、囚犯以及处于社会边缘的群体等高感染率人群[5]、[6]、[7]。在这些群体中，静脉采血检测往往不太可行，因为需要专业的医护人员、患者必须前往诊所，或者需要开展外展服务，而且注射毒品者的外周静脉条件可能较差，容易导致诊断遗漏。干血斑检测则可以通过无需抽血的微创毛细血管采血方式克服这些障碍，简化操作流程，还能在常温下运输样本[8]，从而提高在服务不足人群中的检测覆盖率[9]。
现有的干血斑检测流程往往缺乏基因型和耐药性数据，这就需要再次进行静脉采样，进而增加后续检测的流失率[8]、[10]、[11]。尽快开始抗病毒治疗至关重要，因为治疗延迟会导致病毒继续传播，尤其是在那些流动性大或配合度低的群体中[12]、[13]。全基因组测序可以通过对整个病毒基因组进行测序，来实现基因型分类、检测耐药相关突变，并为系统发育分析提供依据，从而帮助克服上述问题[14]、[15]。在泛基因型检测选项有限的情况下，准确的基因分型有助于选择合适的抗病毒药物；而耐药相关突变的检测则能为治疗失败后的重新治疗提供依据[16]。在全基因组测序在公共卫生领域的应用还包括传播趋势分析以及消除目标的监测工作[17]、[18]、[19]。
全基因组测序已被用于大规模的丙型肝炎病毒监测工作，比如英国国家医疗服务体系开展的利用剩余血浆样本的监测项目[20]，但在偏远地区或资源匮乏的环境中往往无法获得血浆样本。基于扩增子的检测方法也存在一些缺陷，比如需要针对特定基因型设计引物、容易出现检测缺失以及扩增偏差等问题[21]。混合捕获技术则可以通过使用能够容忍序列不匹配的探针，同时实现对多种丙型肝炎病毒基因型的富集，从而解决这些问题[20]、[22]。我们认为，这项研究是首个验证基于混合捕获技术的干血斑样本丙型肝炎病毒全基因组测序方法，并评估其是否适用于常规诊断工作的研究。干血斑全基因组测序能够快速提供分散式的基因组数据，有助于优化临床诊疗流程，为消除丙型肝炎病毒感染贡献力量。
章节节选
样本选择与处理
我们在2024/25年度通过曼彻斯特医学微生物学合作组织，收集了147份丙型肝炎病毒RNA阳性临床干血斑样本以及24份常规护理过程中采集的临床血浆样本，对其进行了检测。其中只有部分样本的基因型及药物耐药性信息是已知的。这些样本的匿名检测已获得伦理批准，批准编号为REC ref: 24-NI-0016。
我们使用WHO第6版1a型丙型肝炎病毒国际标准样本的七组系列稀释液（浓度范围为233,636–3,651 IU/mL），来评估该检测方法的分析灵敏度。
结果
共分析了171份临床样本（24份血浆样本和147份干血斑样本）。根据大于30倍读取深度下大于50%的基因组覆盖度标准，干血斑样本中有7份（占比4.76%）出现测序失败，血浆样本中有1份（占比4.2%）出现测序失败。大多数测序失败的样本都是Ct值较高的干血斑样本，其中4份的Ct值大于32，占比为57%。有一份血浆样本的Ct值为25.3，尽管多次尝试测序仍失败，另一份干血斑样本的Ct值为23.6，同样未能成功完成测序。值得欣慰的是，这些测序失败的情况分布较为均匀。
讨论
本研究表明，混合捕获全基因组测序技术能够从血浆样本和干血斑样本中可靠地生成高质量的全基因组序列。该检测方法达到了各项主要的分析性能指标，因此适用于临床诊断和公共卫生领域。研究结果与已有文献一致，即混合捕获技术能够在不同的基因型和样本类型中保持稳定的检测性能，即便样本中的病毒RNA数量或质量存在差异[20]、[23]。该检测流程能够准确地对样本进行基因分型，最常见的基因型为1a型和3a型。
CRediT作者贡献说明
Emma Ann Davies： 文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，项目监督，项目管理，正式数据分析。Jean L Mbisa： 文章撰写——审阅与编辑，软件使用，方法设计，实验研究。David F Bibby： 文章撰写——审阅与编辑，方法验证，软件使用，实验研究，数据整理。Nicholas Machin： 文章撰写——审阅与编辑，项目监督，项目管理。Benjamin Brown： 文章撰写——审阅与编辑，项目监督，项目管理。phillips catherine： 文章撰写——
利益冲突声明
作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：Catherine Phillips表示，她收到了QIAGEN Manchester Ltd提供的设备、药品或相关物资。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者们要感谢曼彻斯特医学微生物学合作组织的员工们在样本处理以及常规诊断检测工作中给予的大力支持。
