《VIEW》：Advances in deep-tissue fluorescence imaging through optical clearing: A review
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荧光成像（Fluorescence Imaging)是生物医学领域中一种广泛应用的光学技术，能够以高分辨率和细胞水平分子特异性对生物样本进行检测，包括癌症活检。然而，样本内部异质性结构引起的光散射使得深层组织成像变得困难。组织成分之间的折射率(Refracti
荧光成像（Fluorescence Imaging)是生物医学领域中一种广泛应用的光学技术，能够以高分辨率和细胞水平分子特异性对生物样本进行检测，包括癌症活检。然而，样本内部异质性结构引起的光散射使得深层组织成像变得困难。组织成分之间的折射率(Refractive Index, RI)失配是散射的主要原因，限制了成像深度。为解决这一问题并增强光在样本中的穿透能力，组织光学透明化(Optical Clearing)技术应运而生，该技术通过降低组织异质性来最小化光散射并改善光穿透深度。近年来，光学透明化程序在生物研究中取得了多项进展。尽管已有多篇关于光学透明化技术的综述，但尚未有聚焦于其在荧光成像中应用的文献。本综述考察了将光学透明化方法与荧光成像相结合的各类研究，重点关注所采用的成像技术及其在诊断和病理学中的应用。荧光信号的来源与保存策略也在文中进行了详细讨论。
1 引言
先进成像技术能够在保持天然组织结构的同时，以细胞和亚细胞空间分辨率对生物材料进行三维(3D)体成像重建，这受到科学家尤其是生物医学领域研究者的高度关注。光学成像在发展的同时，本质上仍是一种微创至无创的技术。光学相干层析成像(Optical Coherence Tomography, OCT)、拉曼显微术(Raman Microscopy)、光声成像(Photoacoustic Imaging)、共聚焦显微术(Confocal Microscopy)、多光子显微术(Multiphoton Microscopy, MPM)、激光散斑成像(Laser Speckle Imaging)、光片荧光显微术(Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM)、超分辨率成像(Super-resolution Imaging)等先进技术，代表了光学成像从传统显微镜发展而来的历程。这些成像方法依赖于多种光-组织相互作用，包括光吸收、荧光发射和散射过程。
荧光成像因其无创、无电离辐射、实时检测能力以及高对比度图像的优势，已成为检测生物样本的首选工具之一。生物组织中的荧光信号可来自引入特定组织成分的外源性荧光探针，或生物系统内具有自发荧光的内源性生物分子。多种荧光成像技术已广泛应用于研究和医学领域，包括宽场荧光显微镜、双光子显微镜、共聚焦荧光显微镜和LSFM等。然而，对生物样本进行光学探测时面临的主要问题是光的显著散射。生物组织具有异质性结构，包含胶原、细胞质、弹性蛋白、水和脂质等多种成分，这些成分会引起显著的光散射，导致信号严重衰减、穿透深度受限和背景噪声增加。光学透明化技术通过使用化学试剂使组织微环境中的折射率均一化，从而减少散射事件并增强光学透明度。
2 光学透明化的原理与技术概述
折射率匹配仍然是光学透明化的主要方法，但将其应用于不同组织模型或器官取决于其成分和微观结构。常用策略包括脱水联合脱脂后浸入有机溶剂（如苯甲醇/苯甲酸苄酯、四氢呋喃、叔丁醇、乙基肉桂酸酯(Ethyl Cinnamate, ECi)），或使用亲水性的折射率匹配试剂如甘油、果糖（See Deep Brain, SeeDB）、或尿素基溶液等水性方案。其他程序还包括针对矿化组织（如骨骼）的脱钙处理（常用乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA)），以及增加透明度的过度水合（通常使用尿素基溶液）。对于有色组织，额外的漂白步骤（如使用过氧化氢）可减少光吸收和背景噪声。
有机溶剂法如苯甲醇:苯甲酸苄酯(Benzyl Alcohol:Benzyl Benzoate, BABB)和DISCO家族（3DISCO、iDISCO及其变体uDISCO、vDISCO和FDISCO）广泛用于器官和大样本的快速深层透明化，也适用于血管和神经成像。水性方法如SeeDB（果糖基）、CUBIC（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis）、SCALE（Simple CLARITY-based Approach for Large-scale Tissue Examination）和FRUIT（Fructose and Urea-based Tissue Clearing Method）已被开发用于脑组织透明化，可在小鼠及其他哺乳动物样本中实现亚细胞分辨率成像。水凝胶法包括CLARITY（Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel）及其变体（如PACT（Passive CLARITY Technique）、PARS（Perfusion-assisted Agent Release in situ）等）、SWITCH（System-wide Control of Interaction Time and Kinetics of Chemicals）和SHIELD（Stabilization under Harsh conditions via Intramolecular Epoxide Linkages to prevent Degradation）。这些方法各有优劣：溶剂的用户通常更快、穿透更深，但可能引起组织收缩和荧光猝灭；水性和水凝胶法能更可靠地保存荧光蛋白和组织形态，但对致密、结缔组织或钙化组织效果较慢或较差。近年来，一种使用硼酸三甲酯的单步脱水(Single-step Dehydration, SSD)溶剂法透明方法被报道，与3DISCO相比，成年小鼠器官的总透明化时间缩短了70%。
3 共聚焦荧光显微术
共聚焦荧光显微术是一种通过共聚焦性消除焦平面上下方平面的离焦荧光或散射光，从而获得深度分辨高对比度和高分辨率图像的关键显微技术。光通过由不透明圆盘上的小孔形成的针孔，该针孔作为空间滤光器去除离焦平面信号。这种设置使得仅来自焦平面的无背景高对比度信号到达探测器。通过改变焦平面，可以获取亚微米厚度的单个光学切片，并借助适当的软件组合生成样本的3D体图像。
研究人员在多种样本上应用了光学透明化辅助的共聚焦显微术。Boutin和Hoffman-Kim对大鼠神经干细胞、C6胶质瘤细胞和原代皮层神经元培养的3D球体进行了体外成像。在使用ClearT2透明化处理后，共聚焦成像深度从30 μm增加到100 μm，同时保持了组织形态和免疫标记兼容性。Shi等人开发了足垫皮肤光学透明化试剂(Footpad Skin Optical Clearing Agent, FSOCA)用于Cx3cr1-GFP小鼠的活体成像，通过激光扫描共聚焦显微术(Laser-scanning Confocal Microscopy, LSCM)在488 nm激发波长下实现了对GFP标记单核细胞的活体观察，透明化处理约15分钟后单核细胞可见度显著增强。该协议进一步应用于糖尿病和非糖尿病Cx3cr1-GFP小鼠的迟发型超敏反应(Delayed-type Hypersensitivity, DTH)模型研究，结合时间推移共聚焦显微术，实现了炎症过程中浅层和深层真皮层单核细胞募集和运动的动态可视化。
Foster等人采用改良的BABB光学透明化工艺对表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)的转基因小鼠皮肤和其他软组织进行整体成像。与未透明化样本通常达到的4-6 μm成像深度相比，改良的BABB技术使透明化组织的共聚焦成像深度达到约500 μm。Tuchina等人研究了临床批准的磁共振造影剂（如钆布醇）作为光学透明化试剂的潜力，通过时间相关单光子计数(Time Correlated Single-photon Counting, TCSPC)共聚焦显微术，肿瘤荧光-背景强度比提高了五倍。另一项研究中，研究人员通过改良的Sca/eS透明化结合荧光成像，使用共聚焦荧光显微术可视化小鼠耳蜗结构，探索了细胞和血管特征，并通过CX3CR1-GFP小鼠实现了巨噬细胞追踪。
4 多光子显微术
多光子显微术(Multiphoton Microscopy, MPM)相比传统单光子激发技术有显著优势。该技术依赖于两个或多个低能量光子近乎同时被吸收以激发荧光团，通常使用飞秒脉冲宽度的超短脉冲激光实现。由于非线性激发过程需要高光子密度，多光子激发仅在局部焦点体积内发生，从而实现固有的光学层析能力，无需物理针孔即可实现3D成像。另一种可由高光子密度激发实现的非线性光学过程是二次谐波产生(Second Harmonic Generation, SHG)，这是一种不涉及荧光团吸收或发射的相干散射现象，特别适用于成像高度有序的非中心对称生物结构如胶原。
TDE（2,2'-硫代二乙醇）被研究作为水性透明化试剂以改善小鼠脑组织的多模态非线性光学成像性能。脑组织切片经TDE/PBS溶液孵育后，通过双光子荧光显微术(Two-photon Fluorescence Microscopy, TPFM)成像，结果显示遗传编码的荧光蛋白信号保存良好，光漂白或猝灭最小。该透明化方案被调整用于整个小鼠海马的序列双光子断层扫描和3D重建，增强了穿透深度，使树突棘、膨大多端体和孤立神经元突起等解剖区域和亚细胞特征的深层可视化成为可能。
Olson等人采用BABB光学透明化技术对人类肾组织标本进行多光子成像。经甲醛固定后，透明化步骤包括甲醇脱水和BABB溶液浸入。使用DAPI和曙红进行细胞核和蛋白质染色。通过多光子扫描在不同光学深度增强了分辨率和清晰度，这些图像经过RGB光学密度映射伪彩色处理以模拟传统的苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)染色外观。3D重建进一步增强了肾小球囊等结构的可视化，同时利用SHG成像可视化组织内的胶原分布。
Zhao等人开发了颅骨光学透明窗口(Skull Optical Clearing Window, SOCW)用于小鼠皮层神经元和血管的活体成像。光学透明窗口包括用于幼鼠胶原结构分解的胶原酶、用于老年鼠脱钙的EDTA二钠，以及用于折射率匹配的甘油。双光子荧光成像实现了突触分辨率，允许可视化树突棘。Sdobnov等人对猪耳皮肤组织进行多光子断层扫描以观察双光子激发自发荧光(Two-photon Excitation Autofluorescence, TPEAF)和SHG，评估了甘油和碘海醇(Omnipaque?)两种透明化试剂的效果，发现60%甘油-水溶液对深层成像最有效，而100%甘油增强了表层信号但导致更大的组织收缩。Schneidereit等人引入了无标记多光子成像方法研究小鼠骨骼肌，组织样本分别经TDE水溶液和DBE、ECi溶剂透明化处理，透明化方法将成像深度增强至600 μm，其中TDE处理的样本展示了自发荧光信号的保存和最小的组织收缩。
5 光片荧光显微术
光片荧光显微术(Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM)通过将激发光路和检测光路正交布置，实现了对大体积样本动态过程的长时间捕获，同时最小化光损伤并保持足够的时空分辨率。激发光通常使用柱面透镜整形为薄片，照亮检测物镜焦平面的特定光学切片。检测装置通常使用敏感的sCMOS（Scientific Complementary Metal-oxide-semiconductor）或EMCCD（Electron-multiplying Charge-coupled Device）相机，从样本中心捕获宽场荧光图像。然而，LSFM存在由于组织内散射、折射或吸收引起的照明条纹伪影问题，可通过组织透明化技术使组织更加光学透明来最小化。
uDISCO（Ultimate Three-dimensional Imaging of Solvent-cleared Organs）被引入作为光学透明化协议，以改进先前已知的导致内源性荧光猝灭的3DISCO方法。在GFP表达的Thy1-GFP-M小鼠上进行的实验实现了神经元结构的可视化和映射。uDISCO适用于内部器官以及骨骼等硬钙化组织，整体透明化后的LSFM成像实现了亚细胞分辨率，允许在整个完整中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)包括脑和脊髓中追踪神经元结构。与PACT或CUBIC相比，uDISCO处理引起的组织收缩使单帧成像体积增加了两到三倍。
由于眼睛的不同解剖成分和视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium, RPE)中对光学透明化具有抵抗性的有色细胞，眼睛仍然特别难以透明化。为此，改良的非侵入性光学透明协议EyeCi被开发并应用于分离的小鼠眼睛，结合iDISCO+方案的免疫标记和改良ECi透明化协议，实现了LSFM的完整3D成像。尽管存在组织收缩效应，该方法保存了关键解剖特征，包括视网膜和脉络膜血管的3D组织，并允许在完整有色小鼠眼睛内清晰观察血管和周血管网络。
Jacob等人报告了基于组织透明化增强的固有自发荧光信号对多种小鼠组织进行表征，无需外部染色或荧光标记。组织经固定、乙醇脱水和简化EyeCi协议透明化后，使用LSFM在405 nm至785 nm的激发波长范围内成像。为验证自发荧光成像协议，研究人员对小鼠肝组织进行了模拟临床诊断程序的肝活检，自发荧光图像使用基于人工智能(Artificial Intelligence, AI)的机器学习(Machine Learning, ML)工具（WEKA）进行3D组织区域分割，表明了未来诊断应用的潜力。另一项近期研究使用改良的eCUBIC（Enhanced Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis）透明化协议处理分离的海马，结合抗Iba1原发和荧光二级抗体的免疫标记，以及小胶质细胞中编码的tdTomato内源荧光，通过LSFM对小胶质细胞的3D形态和结构进行了检查，包括透明化单独处理和透明化加膨胀处理以改善小胶质细胞结构的观察。为观察炎症期间小胶质细胞的结构变化，研究人员通过注射脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)建立了脓毒症模型。
6 讨论与展望
本综述简要讨论了各种光学透明化技术及其优势和内源性荧光保存能力，详细考察了这些光学透明化技术与包括光片、共聚焦和多光子荧光显微术在内的先进深层组织荧光成像模态的结合应用。在这些报道的技术中，LSFM为透明化组织提供了多项优势：平面照明和扫描虚拟光片dalpppp.");
printf("片照明导致较低的光毒性和光漂白，同时能够快速高分辨率地对大型光学透明样本如整个器官（包括脑）进行体成像。另一方面，共聚焦荧光显微术提供了更高的横向分辨率，但由于其基于针孔的序列点扫描方法，对大型体积成像效率较低，限制了透明化样本的成像速度和深度。MPM由于更长波长（通常在红外范围）和高度受限的多光子激发体积，在未透明化的深层组织中固有地减少了散射和光毒性。对于光学透明化样本，MPM在穿透深度上相对于LSFM的优势减弱，而LSFM对大型完全透明样本的快速体成像3D成像速度变得更为有利。尽管如此，MPM仍是活体成像和较厚或部分透明样本的有利选择，在这些样本中仍存在显著散射。
从文献综述可以看出，先进荧光显微技术与光学透明化的结合对于全器官细胞分辨率成像具有变革性意义。然而，选择合适的光学透明化和成像技术组合对于获得最佳结果至关重要。当处理宏观样本时，重点从仅仅获得更深成像转向强调高通量3D数据采集和维持荧光团完整性。尽管大多数光学透明化测量主要在离体条件下进行，但近年来研究人员越来越关注将这些技术扩展到活体应用。关键挑战在于识别能够实现可逆光学生物透明化同时最小化组织损伤和毒性的协议。用于活体成像的光学透明化协议应具有生物相容性，仅诱导短暂和可逆的变化，并必须保存组织的结构完整性。皮肤的光学透明化是活体光学透明化研究中探索最广泛的领域，因其易于接触。
此外，研究已经超越了离体组织研究，向靶向器官特异性局部活体应用发展，如用于小鼠皮层成像的完整颅骨光学透明窗口(Through-intact-skull Optical Clearing Window, TIS-OCW)技术。虽然已有多项研究集中于通过外源性染料、免疫标记和遗传编码荧光蛋白增强荧光标记，但关于保存和利用内源性自发荧光信号进行荧光显微术的研究仍然有限。尽管自发荧光信号相对较弱，但它们可以提供无需外部标记的固有价值对比。这凸显了进一步研究以保存和有效利用这些信号进行成像应用的必要性。结合光学透明化与荧光保存和AI分析可能为更快更准确的成像开辟新可能性，AI模型还可以通过结合从未透明化样本捕获的常规二维图像和从光学透明化样本捕获的3D体图像来重建更真实的数据。
