《Journal of Ethnopharmacology》：A cell-based affinity mass spectrometry strategy for the rapid discovery of active components from Chinese herbal formulae: Chai-Gui decoction as a study case
编辑推荐：
民族药理学相关性
作为天然产物的复合体系，传统中药（TCMs）复方构成了新型药物发现的丰富资源。然而，其成分的复杂性给生物活性成分的鉴定带来了显著挑战。柴归汤（CGD）是两首经典方剂的组合，常用于妇科治疗，但其活性成分迄今尚未得到明确表征。
研究目的
本
民族药理学相关性
作为天然产物的复合体系，传统中药（TCMs）复方构成了新型药物发现的丰富资源。然而，其成分的复杂性给生物活性成分的鉴定带来了显著挑战。柴归汤（CGD）是两首经典方剂的组合，常用于妇科治疗，但其活性成分迄今尚未得到明确表征。
研究目的
本研究旨在建立一种基于细胞的亲和质谱策略，用于从复杂中药复方中快速发现活性成分。本研究选择柴归汤（CGD）作为示例，并以G蛋白偶联雌激素受体（GPER）作为靶点。
材料与方法
研究人员建立了稳定过表达GPER-1的HEK293-T细胞系，并与CGD孵育以执行配体筛选。收集细胞膜片段后，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）分离并鉴定与配体结合的成分。通过分子对接计算捕获配体对GPER的理论结合亲和力。对表现出最高理论亲和力的化合物，进一步采用细胞热转移实验（CETSA）进行结合验证，并通过细胞实验确认其活性。
结果
研究建立了一种新型“钓取”检测方法，该方法整合了活细胞中的配体-受体结合、细胞膜提取与裂解，以及液相色谱-质谱鉴定。与载体对照细胞相比，CGD提取物中的7种化合物在GPER过表达细胞中显示出显著更高的检出水平。分子对接分析进一步表明，这些化合物与GPER蛋白之间具有较高结合亲和力。其中，预测亲和力最高的两种化合物16α-羟基灵芝酸（16α-HTA）和泽泻醇A（Alisol A）通过在CETSA中改变GPER热稳定性而被证实可与GPER结合。后续细胞研究显示，16α-HTA和泽泻醇A在低剂量下可降低GPER表达，并以不依赖表皮生长因子受体（EGFR）的方式抑制AKT磷酸化。
结论
本研究提出了一种可行策略，整合了细胞提取、UPLC-QTOF/MS分析、分子对接模拟、CETSA以及基于细胞的实验，从而能够有效探索并验证复杂混合物中蛋白质靶点的配体。
该论文发表于《Journal of Ethnopharmacology》，围绕中药复方活性成分发现这一关键问题，提出并验证了一种基于活细胞的亲和质谱筛选策略。研究背景在于，天然产物及其衍生物长期是小分子药物发现的重要来源，而传统中药复方因成分高度复杂、靶点作用多样，兼具巨大的药物发现潜力与显著的方法学挑战。现有针对复杂天然产物的活性成分筛选，往往依赖固定化靶蛋白、虚拟筛选或表型筛选等路径，但膜蛋白靶点尤其难以处理。G蛋白偶联雌激素受体（GPER）作为一种7次跨膜受体，在围绝经期高血压相关的血管舒张和血压调控中具有重要作用，但其晶体结构缺乏、膜蛋白稳定性差、内源性配体研究有限，也限制了高效配体发现。因此，直接在活细胞环境中识别GPER配体，具有较高的转化研究价值。
研究选择柴归汤（CGD）作为示范性中药复方。柴归汤由小柴胡汤与当归芍药散化裁而来，长期用于妇科及围绝经期相关疾病治疗，既往研究已提示其可改善围绝经期高血压并上调自发性高血压大鼠中的GPER表达。但该方中究竟哪些化学成分可直接作用于GPER，原文指出此前尚不明确。为此，研究人员建立了稳定过表达GPER-1的人胚肾HEK293-T细胞模型，并构建了一套“活细胞孵育—细胞膜提取—结合成分洗脱—质谱鉴定—分子对接—CETSA验证—细胞功能验证”的整合流程，以实现从复杂中药混合物中快速筛得潜在GPER配体，并对高优先级候选分子完成结合与初步功能确认。研究最终鉴定出泽泻醇A（Alisol A）与16α-羟基灵芝酸（16α-HTA）为可与GPER结合的柴归汤活性成分，并发现两者在乳腺癌细胞中可下调GPER表达、抑制AKT磷酸化。该研究的重要意义在于，为复杂中药复方的靶向活性成分发现提供了一个更贴近生理环境的技术框架，也为膜蛋白靶点尤其是GPCR（G protein-coupled receptor，G蛋白偶联受体）配体筛选提供了可推广思路。
主要技术方法概括如下：研究人员首先构建稳定过表达GPER-1的HEK293-T细胞系，并以野生型HEK293-T细胞作为对照；将CGD提取物与活细胞孵育后，分离细胞膜碎片并洗脱结合成分，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）进行鉴定与相对定量；随后利用AlphaFold预测的GPER三维结构开展分子对接，按理论结合自由能排序候选化合物；再以细胞热转移实验（CETSA）验证候选分子与GPER的直接结合；最后在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中，通过Western blot检测GPER、表皮生长因子受体（EGFR）、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）变化，以评估候选配体的初步功能效应。
3.1. Fishing and identified GPER ligands from components in CGD
在这一部分，研究人员首先成功建立了稳定过表达GPER-1的HEK293-T细胞系。定量聚合酶链式反应（qPCR）结果显示，HEK293T-GPER1细胞中GPER-1 mRNA表达较对照HEK293T-NC细胞升高约2000倍，说明模型构建成功。随后，以CGD提取物与该细胞模型孵育，通过细胞膜提取与UPLC-QTOF/MS检测，从CGD中“钓取”能够在GPER过表达细胞中被检测到的结合成分。基于“在GPER过表达细胞裂解物中可检出”这一第一筛选标准，共纳入10个候选化合物，分别为：芍药苷元异构体Albiflorin、芍药苷（Paeoniflorin）、二氢灯盏花苷（Dihydroscutellarin）、鞣花酸（Ellagic acid）、二氢黄芩苷（Dihydrobaicalin）、汉黄芩素A葡萄糖醛酸苷〔Oroxylin A glucuronide，Wogonoside〕、柴胡皂苷A（Saikosaponin A）、2-O-乙酰柴胡皂苷A、16α-HTA及泽泻醇A。进一步比较GPER过表达组与野生型对照组中各化合物经总蛋白归一化后的峰面积，结果表明其中7种化合物仅在GPER过表达细胞中可检出，而在野生型细胞中不可检出，分别为二氢灯盏花苷、鞣花酸、二氢黄芩苷、柴胡皂苷A、2-O-乙酰柴胡皂苷A、16α-HTA和泽泻醇A。这一结果说明，该细胞亲和质谱策略能够在复杂复方背景中缩小候选范围，筛得具备GPER选择性富集特征的潜在配体。
3.2. Molecular docking analysis of ligand-target interactions
在获得候选化合物后，研究人员进一步通过分子对接分析其与GPER的理论结合能力。由于原文指出当时尚无GPER-1的已发表精细三维结构，因此研究使用UniProt数据库中的GPER氨基酸序列，并基于AlphaFold构建三维结构模型。对10种候选化合物进行多次独立对接后，以最低结合自由能作为评价指标。结果显示，16α-HTA和泽泻醇A的对接评分最低，分别为?5.56 kcal/mol和?5.11 kcal/mol，提示二者具有相对更优的理论结合亲和力，因此被确定为后续实验验证的优先候选。进一步的构象分析显示，16α-HTA可与Arg-155、Arg-169和Arg-254形成氢键，并与Arg-253、Ile-93和Thr-92形成疏水相互作用；泽泻醇A则与Arg-169和Lys-171形成氢键，并与Lys-171、Ile-93和Thr-92发生疏水作用。该部分结果表明，两种候选化合物在理论上均可稳定占据GPER活性口袋，并通过氢键和疏水相互作用形成较稳定复合体，为后续实验性靶标结合验证提供了依据。
3.3. Validation of Ligand-GPER binding by cellular thermal shift assay (CETSA)
在该部分，研究人员应用细胞热转移实验（CETSA）对分子对接结果进行实验验证。CETSA的原理是配体与靶蛋白结合后可提高后者的热稳定性，使其在升温条件下更不易变性沉淀。研究在HEK293T-GPER1细胞裂解物中加入10 μmol/L的16α-HTA或泽泻醇A，并设置不同温度梯度处理后检测可溶性GPER蛋白水平。结果显示，与载体对照相比，无论是16α-HTA还是泽泻醇A处理组，在55–70°C范围内均保留了更高丰度的可溶性GPER蛋白；其中泽泻醇A在55、60、65和70°C时表现出明显稳定化作用。该结果直接证明，16α-HTA和泽泻醇A均可与GPER发生物理结合，并通过提高其热稳定性反映出靶点结合效应。至此，研究完成了从活细胞筛选到计算预测再到实验性靶点结合验证的关键闭环。
3.4. Functional effects of alisol a and 16α-HTA on GPER-Mediated signaling
在完成结合验证后，研究人员进一步考察两种候选配体对GPER相关信号转导的功能影响，采用MDA-MB-231人乳腺癌细胞作为模型，并以EGFR/PI3K-AKT轴为观察指标。Western blot结果表明，泽泻醇A和16α-HTA在0.5、1和5 μmol/L浓度下均可显著降低GPER蛋白表达。进一步分析显示，在低剂量0.5 μmol/L时，两者均可显著降低p-AKT/AKT比值，提示AKT磷酸化受到抑制；这一变化方向与GPER拮抗剂G-15相一致。值得注意的是，在上述条件下EGFR表达未见显著变化，说明这两种化合物对AKT磷酸化的抑制作用并不依赖EGFR表达变化。原文还指出，0.5 μmol/L 16α-HTA可增加总AKT表达，而G-15仅在5 μmol/L时才降低p-AKT表达。综合而言，这一部分说明16α-HTA与泽泻醇A不仅能够结合GPER，而且在细胞水平上表现出调节GPER相关下游信号的活性，具体体现为低剂量条件下下调GPER表达并抑制AKT磷酸化。
讨论部分总结
讨论部分首先强调，天然产物尤其是中药复方的复杂性，使得活性成分与靶蛋白之间的对应关系难以厘清。传统基于固定化靶蛋白或膜片段的亲和筛选方法，存在难以维持内源性蛋白天然构象与细胞环境的问题，因此研究提出以活细胞为载体进行配体捕获，再结合质谱进行成分鉴定，从而提高筛选的生理相关性并简化操作流程。围绕CGD，研究将此前已知的174个化学成分背景缩小到10个可在GPER过表达细胞中检出的候选，再进一步筛得7个对GPER过表达细胞具有选择性富集的候选配体，显示出该策略对复杂体系具有较强的去卷积能力。随后，分子对接与CETSA共同支持16α-HTA和泽泻醇A是最有前景的GPER结合成分，而细胞功能实验则提示其可影响GPER-AKT信号轴。
讨论中还指出，CGD在既往自发性高血压大鼠研究中可上调GPER表达，但本研究中16α-HTA和泽泻醇A在MDA-MB-231细胞中却下调GPER表达并抑制p-AKT，这一现象反映出不同疾病背景、不同细胞环境中GPER生物学作用的差异。不过原文同时明确列出了研究局限：该策略依赖化合物进入细胞、胞内稳定性以及裂解洗涤过程中的保留能力，可能产生假阴性；HEK293过表达模型属于人工细胞背景，可能影响真实组织中的结合动力学与特异性；功能验证仅限于Gβγ介导的EGFR-PI3K-AKT轴，尚未覆盖其他GPER下游信号通路。整体而言，讨论部分认为，该方法为中药复方及其他复杂混合物中的蛋白靶点配体发现提供了具有应用潜力的技术参考。
结论部分翻译
本研究成功建立了一种新颖且综合性的复杂混合物活性成分筛选策略，并以柴归汤（CGD）为例进行了示范。该整合策略包括基于活细胞的配体钓取，即结合活细胞捕获、细胞膜收集与裂解，以及通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）进行快速鉴定。系统性验证包括通过分子对接进行理论亲和力计算和候选优先级排序，以及采用细胞热转移实验（CETSA）和细胞功能实验进行实验验证。研究结果明确鉴定出泽泻醇A（Alisol A）和16α-羟基灵芝酸（16α-HTA）为能够与G蛋白偶联雌激素受体（GPER）结合的柴归汤生物活性成分。该研究所呈现的流程为传统草药中活性配体的系统发现提供了一个方法学框架。
