人参总皂苷通过PI3K-AKT通路在快速双系统衰老筛选模型中延缓衰老和细胞衰老

《Journal of Ginseng Research》：Total saponins from Panax ginseng delay aging and cellular senescence via PI3K-AKT pathway in a rapid dual-system screening model of aging

　　

**背景** 衰老作为一个不可避免的生物学过程，是多系统功能下降的必然过程，细胞衰老是其标志之一。尽管人参总皂苷（TSG）具有健康益处，但其确切的抗衰老机制尚未完全阐明。
**方法** 本研究利用叔丁基过氧化氢（tBHP）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和秀丽隐杆线虫（C. elegans）衰老，建立了一个快速的双系统衰老筛选模型。通过荧光染色、蛋白质印迹（WB）、生化及行为学分析评估了TSG的抗衰老效应和关键成分。利用生物信息学分析、WB、AKT激活剂以及C. elegans中的功能缺失突变体，阐明了TSG通过PI3K-AKT信号通路产生的抗衰老和抗细胞衰老效应。
**结果** TSG缓解了氧化应激，增强了抗氧化能力，并降低了β-半乳糖苷酶活性，表明其延缓了衰老。它还调节了衰老相关标志物并增加了Ki-67表达，支持其促进增殖和抑制细胞衰老的作用。在筛选的20种人参皂苷中，原人参二醇（PPD）、人参皂苷F1（F1）和人参皂苷Rh1（Rh1）被确定为主要活性成分。网络药理学和实验验证揭示了PI3K-AKT通路是TSG作用的核心。AKT1和PI3K被确认为靶点，并观察到其磷酸化水平降低。在功能缺失突变体线虫akt-1;akt-2和age-1中，TSG的抗衰老效应部分被消除，证实了PI3K-AKT信号通路在体内的关键作用。
**结论** 本研究建立了一个用于衰老研究的快速双系统模型，并证明TSG及其主要皂苷（PPD、F1和Rh1）通过下调PI3K/AKT磷酸化，经由PI3K-AKT通路减轻衰老和细胞衰老。

**研究背景与意义**
衰老是随时间推移由生物改变累积导致的普遍过程，与认知和身体功能下降以及多种疾病（如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病）风险升高相关。年龄相关疾病严重影响生活质量并增加死亡风险，对社会和个人构成严峻挑战，因此开发有效的抗衰老疗法迫在眉睫。细胞衰老是衰老的标志之一，其特征是不可逆的增殖停滞状态，伴随功能、结构和形态的改变。衰老生物体的主要特征是细胞衰老的积累，这是由不同损伤刺激引起的永久性细胞周期停滞。衰老细胞的积累加速衰老并促进年龄相关的组织功能障碍，因此靶向细胞衰老是开发抗衰老干预措施的一个有前景的途径。

传统上，复制性衰老能较好地模拟生理性衰老，但耗时长且成本高。鉴于氧化应激是衰老的主要因素，过氧化氢（H₂O₂）等氧化剂曾被用于模拟衰老，但其不稳定性限制了实验的可重复性。叔丁基过氧化氢（tBHP）是一种稳定的有机过氧化物，能产生持续的细胞内氧化应激。基于其稳定和一致的作用，本研究选择tBHP来建立快速衰老模型，用于体内和体外分析。秀丽隐杆线虫因其2-3周的短寿命而成为衰老研究的有价值模型。tBHP暴露可在数小时至数天内在C. elegans中诱导衰老表型，从而实现快速的体内筛选。在衰老的人类中，衰老的内皮细胞会导致血管功能障碍及相关疾病，如高血压、糖尿病和神经退行性疾病。因此，本研究选择tBHP处理的人脐静脉内皮细胞作为体外衰老模型。通过结合这些快速的体内外模型，本研究旨在促进发现具有抗衰老潜力的新型候选化合物并探索其机制。

在亚洲，人参作为一种传统中药，兼具食用和药用价值。已有文献表明，人参总皂苷具有多种健康益处，包括抗癌、抗氧化和抗炎作用。然而，由于天然提取物的多靶点和多通路特性，TSG确切的抗衰老机制、效应和活性成分尚不清楚。本研究建立了一个快速的双系统衰老筛选模型，以验证TSG的抗衰老和抗细胞衰老效应及其活性成分，并观察TSG通过调节PI3K-AKT信号通路（通过PI3K/AKT磷酸化）发挥其作用，这得到了计算机模拟、体外和体内分析的支持。这些结果为支持TSG作为抗衰老补充剂的潜力提供了基础证据。

**关键研究方法**
本研究采用乙醇回流提取法从五年生人参干燥根中制备TSG，并通过高效液相色谱（HPLC）分析了TSG及20种人参皂苷单体的相对含量。研究建立了一个快速的双系统衰老筛选模型：在体外，使用tBHP诱导HUVECs衰老；在体内，使用tBHP诱导C. elegans衰老。抗衰老效应通过细胞活力（MTT法）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、Ki-67核染色、氧化应激指标（超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA、活性氧ROS）测定、蛋白质印迹（WB）以及线虫寿命和行为学实验进行评估。网络药理学用于探索TSG的抗衰老机制靶点，并通过分子对接、AKT激活剂（SC79）处理和功能缺失突变体线虫（age-1和akt-1;akt-2）实验验证了PI3K-AKT通路的关键作用。

**研究结果**
**3.1. TSG在tBHP诱导的HUVECs中延缓衰老**
通过MTT实验确定了建立HUVECs衰老模型的最佳条件（20 μM tBHP，处理5小时）。tBHP处理显著增加了SA-β-gal活性，降低了SOD和GSH水平，提高了MDA和ROS水平，成功建立了衰老模型。TSG处理（10、25、50 μg/mL）剂量依赖性地降低了SA-β-gal活性，提高了SOD和GSH水平，降低了MDA和ROS，表明TSG能缓解氧化应激，增强抗氧化酶活性，延缓HUVECs的衰老。

**3.2. TSG在tBHP诱导的HUVECs中抑制细胞衰老**
Ki-67染色显示，TSG处理逆转了tBHP诱导的Ki-67表达下降，表明细胞增殖增加。WB分析显示，tBHP暴露提高了p53、p21和γ-H₂A.X（DNA损伤标志）的表达，降低了核纤层蛋白B1（Lamin B1）的表达。高剂量TSG处理显著下调了p53和p21表达，恢复了Lamin B1水平，并降低了γ-H₂A.X表达。这些结果表明，TSG通过增加细胞增殖和调节关键衰老相关标志物来减轻细胞衰老。

**3.3. TSG延长tBHP诱导的C. elegans寿命并延缓衰老**
在tBHP诱导的快速衰老线虫模型中，TSG处理（100、200、400 μg/mL）显著提高了N2野生型线虫的存活率，分别延长了18.85%、27.70%和21.88%。TSG处理恢复了tBHP下调的抗氧化酶基因（gst-4, gst-7, sod-3, hsp-16.2）的mRNA表达，并在GFP报告株中增加了SOD-3和GST-4蛋白水平。在正常培养条件下，慢性TSG处理也能剂量依赖性地显著延长线虫寿命（分别延长10.95%、27.64%和20.59%）。行为学实验排除了饮食偏好或摄入量改变的影响，表明寿命延长是TSG直接的抗衰老效应。

**3.4. TSG来源的皂苷单体PPD、Rh1和F1在tBHP诱导的HUVECs和C. elegans中延缓衰老和抑制细胞衰老**
HPLC分析确定了TSG中20种皂苷单体的相对含量。在tBHP诱导的C. elegans快速筛选模型中，200 μM的PPD、Ra2、Rh1、Rg1和F1处理能显著延长线虫寿命。在HUVECs模型中，50 μM时这五种单体均能抑制SA-β-gal活性；但在较低剂量（10和25 μM）下，只有PPD、Rh1和F1显著降低SA-β-gal活性，并提高SOD和GSH水平，降低MDA和ROS水平。此外，PPD、Rh1和F1处理增加了Ki-67表达，下调了p53、p21和γ-H₂A.X蛋白表达，恢复了Lamin B1水平。因此，PPD、Rh1和F1被确定为TSG抗tBHP诱导衰老的主要活性成分。

**3.5. 通过计算机模拟识别TSG抗衰老和抗细胞衰老的潜在靶点**
网络药理学分析确定了106个TSG与衰老相关的重叠靶点。PPD型皂苷有83个衰老相关靶点，PPT型有43个。蛋白-蛋白相互作用网络分析确定了10个核心靶点，包括STAT3、AKT1、HSP90AA1、PIK3CA等。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些靶点显著富集于PI3K-AKT信号通路等与衰老相关的通路，提示该通路是TSG延缓衰老的关键机制。

**3.6. TSG及皂苷单体PPD、Rh1和F1调节tBHP诱导的HUVECs中PI3K/AKT磷酸化**
分子对接显示，PPD、Rh1和F1能与AKT1和PI3K形成稳定的复合物。WB实验表明，TSG及PPD、Rh1和F1处理显著降低了tBHP诱导的HUVECs中p-AKT和p-PI3K的水平，但对HSP90蛋白水平无显著影响。这表明TSG及其活性皂苷通过抑制PI3K和AKT的磷酸化来抑制PI3K-AKT通路。

**3.7. TSG及皂苷单体PPD、Rh1和F1通过PI3K-AKT通路延缓tBHP诱导的衰老**
使用AKT激活剂SC79（2 μM）处理HUVECs，发现其激活AKT后促进了衰老表型（增加SA-β-gal活性，降低Ki-67表达，上调p53、p21、γ-H₂A.X，下调Lamin B1）。TSG与SC79共处理可逆转这些变化。在线虫体内实验中，PI3K同源基因age-1和AKT同源基因akt-1/2的功能缺失突变体（age-1(hx546)和akt-1(ok525);akt-2(ok393)）对tBHP诱导的衰老具有抵抗性，寿命显著延长。在age-1和akt-1;akt-2突变体中，TSG延长寿命的效应部分减弱或消失。同样，PPD、Rh1和F1在野生型线虫中延长寿命的效应在这些突变体中也未观察到。这些体内外结果共同表明，TSG及其主要活性成分的抗衰老效应部分依赖于PI3K-AKT通路。

**讨论与结论**
本研究结合传统中药功效和现代研究，开发了用于衰老研究的快速双系统模型，并证明TSG及其主要皂苷（PPD、F1和Rh1）通过抑制PI3K/AKT磷酸化，从而抑制PI3K-AKT信号通路，减轻衰老表型和细胞衰老。AKT1和PI3K是PI3K-AKT通路的核心组件，该通路是凋亡、增殖和代谢的关键调节因子，与衰老及相关疾病密切相关。TSG的抗衰老靶点并非孤立作用，而是通过多靶点级联反应，这与人参多组分、多通路生物活性的特点一致。

研究对tBHP诱导的快速衰老模型与生理性衰老的异同进行了讨论。两者在p53/p21通路上调、SA-β-gal活性增加、ROS积累等核心特征上具有一致性。但tBHP模型是在简化的氧化应激条件下建立的，无法完全模拟体内衰老涉及的多因素相互作用（如免疫监视、慢性低度炎症、代谢变化）。未来研究需使用复制性衰老模型或自然衰老动物模型进行交叉验证，以获得更全面可靠的结论。

此外，研究在tBHP诱导的SH-SY5Y神经元细胞中也观察到了TSG类似的抗衰老表型改善，提示其作用可能不限于内皮细胞，具有更广泛的潜在应用价值。关于皂苷单体的筛选，HPLC分析显示PPD、Rh1、F1、Rg1和Ra2是TSG中的主要皂苷。在快速衰老线虫模型中，这五种主要皂苷均显示出延长寿命的效应。然而，在细胞模型中，较低浓度下只有PPD、F1和Rh1显示出显著的抗衰老效力，因此它们被选为代表成分进行后续机制研究。这种效力差异可能与它们的化学结构、作用靶点和在急性氧化损伤模型中的反应特性有关。

研究的转化意义需要药代动力学数据的支持。已有药代研究显示，口服人参总皂苷后，原型成分如Rg1、Rb1及其代谢物Rh1、F1以及PPD在体内可达到一定暴露水平。本研究所用的体外浓度（10 μM）略高于报道的血浆水平，但考虑到体外缺乏蛋白结合和组织积累，此浓度用于功效评估具有一定合理性。未来需要在药代浓度范围内进行体内小鼠研究以进一步验证。

**结论** 本研究证明了TSG如何通过PI3K-AKT通路抵消tBHP的致衰老效应，延缓衰老并预防细胞衰老。同时，开发了一种用于衰老研究的快速双系统筛选方法。AKT1和PI3K成为潜在靶点，关键生物活性皂苷PPD、Rh1和F1被证明贡献了这些抗衰老效应。这些结果促进了针对衰老相关疾病的治疗策略开发，为人参的抗衰老作用提供了药理学和分子学见解。