《Journal of Hazardous Materials Advances》：Chronic graphene oxide exposure as an emerging hazard promotes EMT-associated epithelial plasticity in human keratinocytes
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摘要：石墨烯基材料（Graphene-Based Materials, GBMs）在工业与商业领域的广泛应用使其被认定为新兴环境污染物，但其长期低剂量暴露对健康的影响尚不清楚。大多数纳米安全性研究仍采用急性高浓度暴露模式，难以反映制造、处理、使用及报废过程中可
摘要：石墨烯基材料（Graphene-Based Materials, GBMs）在工业与商业领域的广泛应用使其被认定为新兴环境污染物，但其长期低剂量暴露对健康的影响尚不清楚。大多数纳米安全性研究仍采用急性高浓度暴露模式，难以反映制造、处理、使用及报废过程中可能遇到的慢性低剂量接触场景。研究人员以非致瘤且基因组稳定的永生化人表皮角质形成细胞系HaCaT——代表环境与职业接触的首要屏障——以及裸小鼠异种移植模型，评估了四种GBMs（两种商品化氧化石墨烯Graphene Oxide, GO 1、GO 2和两种少层石墨烯Few-Layer Graphene, FLG 1、FLG 2）在亚慢性（1个月）和慢性（6个月）每周低细胞毒性剂量（0.5和5 μg/mL）暴露下的危害。结果显示，慢性GO暴露诱导了与部分上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）样状态相协调的上皮重塑，包括E-钙黏蛋白向N-钙黏蛋白转换（Cadherin Switch）、闭锁蛋白（Occludin）丢失、β-连环蛋白（β-Catenin）核转位、角蛋白向波形蛋白（Vimentin）中间丝重组、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解增强、克隆形成能力增加及核增大。上述EMT样改变在经亚慢性和慢性暴露细胞构建的裸小鼠异种移植模型中得以重现，其中GO 2在末次暴露后9周仍引发最显著的钙黏蛋白转换和中间丝变化，表明该表型在复杂微环境中具持久性。研究表明，环境及职业相关浓度的长期低剂量氧化GBMs可促使皮肤屏障细胞发生上皮可塑性与EMT相关性状，氧化度和横向尺寸是慢性危害的关键理化决定因素。结果强调在GBMs作为新兴污染物的环境与职业健康风险评估及安全设计（Safe-by-Design）开发中须纳入慢性低剂量暴露情境。
论文解读——《Chronic graphene oxide exposure as an emerging hazard promotes EMT-associated epithelial plasticity in human keratinocytes》
本研究发表于Journal of Hazardous Materials Advances。目前石墨烯基材料（Graphene-Based Materials, GBMs）广泛应用于可穿戴电子、智能纺织品、医用器件及复合材料，使其可能通过生产、磨损、使用及废弃释放成为新兴环境污染物。现有纳米毒理学研究大多采用急性高浓度暴露方案，与实际职业和环境接触中反复、长期低剂量暴露情形脱节，且氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）与少层石墨烯（Few-Layer Graphene, FLG）在长期低剂量下对人皮肤屏障细胞上皮可塑性及EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition，上皮-间充质转化）相关影响尚未明确。皮肤是人体直接接触GBMs的首要屏障，研究人员因此建立亚慢性（每周暴露，持续1个月）与慢性（持续6个月）低细胞毒性浓度（0.5 μg/mL与5 μg/mL）暴露模型，选用非致瘤、基因组稳定的永生化人角质形成细胞HaCaT及裸小鼠异种移植，系统评价四种GBMs（GO 1、GO 2、FLG 1、FLG 2）诱导EMT样上皮重塑的潜力与理化依赖关系，并探讨其毒理学意义。研究发现氧化度较高的GO在长期低剂量暴露下可诱导部分EMT样表型且该改变在体内具持久性，为GBMs慢性危害评估与安全设计提供依据。
主要关键技术方法：
研究人员以HaCaT细胞为模型，建立每周添加GBMs（0.5或5 μg/mL）持续传代至1个月（亚慢性）和6个月（慢性）的低剂量暴露方案，并设置未暴露对照及100 nM亚砷酸盐（Arsenite）为阳性对照。四种GBMs（GO 1源自碳纳米纤维氧化、GO 2源自石墨氧化、FLG 1经三聚氰胺辅助机械化学剥离、FLG 2经葡萄糖辅助机械化学剥离）经HRTEM、TGA、Raman光谱表征理化性质。功能与分子表征包括：Seahorse XFp检测氧耗率（OCR）与胞外酸化率（ECAR）分析线粒体呼吸与糖酵解、Mitotracker CMXros荧光测线粒体膜电位（MMP）、免疫荧光（IF）检测E-Cadherin、N-Cadherin、Occludin、β-Catenin、Pan-Cytokeratin、Vimentin的定位与表达量、克隆形成实验、荧光明胶降解实验测ECM降解能力、核与细胞形态定量分析、划痕实验测迁移能力；将经亚慢性和慢性暴露的HaCaT细胞与Matrigel混合皮下注射至裸小鼠（nu/nu）建立异种移植模型，末次暴露后9周取材行H&E染色及免疫荧光检测E-Cadherin、N-Cadherin、Pan-Cytokeratin、Vimentin。
研究结果：
3.1. Assessment of an in vitro model of subchronic and chronic exposure to GBMs（GBMs亚慢性与慢性暴露体外模型的建立）： 研究人员成功建立每周低剂量（0.5、5 μg/mL）持续1个月与6个月的HaCaT细胞暴露模型，四种GBMs氧化度（GO 1≈48.4%，GO 2≈49.9% > FLG 1≈6.5%，FLG 2≈9.2%）与横向尺寸（GO 2 > GO 1 > FLG 1 > FLG 2）存在差异，模型可用于模拟环境与职业相关长期低剂量接触并排除急性毒性干扰。
3.2. Subchronic and chronic GBM exposure reshapes cellular metabolism（亚慢性与慢性GBM暴露重塑细胞代谢）： Seahorse分析显示亚慢性GO 1暴露上调线粒体ATP合成、基础与最大呼吸及非线粒体呼吸，伴MMP下降提示活性氧（ROS）升高；GO 2、FLG促糖酵解或糖酵解储备增加。慢性暴露整体代谢趋于适应，基础糖酵解降低而糖酵解储备保留，OCR/ECAR比值升高表明更依赖氧化磷酸化，唯最小粒径FLG 2呈轻微基础呼吸增加，说明不同GBMs引发时间依赖性代谢重编程。
3.3. Subchronic and chronic exposure to GBMs induce cadherin shift and redistribution（GBMs亚慢性与慢性暴露诱导钙黏蛋白转换与重分布）： 亚慢性GO 1与GO 2暴露显著降低膜结合E-Cadherin阳性细胞比例并提升膜N-Cadherin；慢性暴露进一步加剧E-Cadherin丢失（除0.5 μg/mL FLG 2外均显著），GO 1与GO 2尤其使>80%细胞出现膜N-Cadherin上调，呈现典型Cadherin Switch，FLG影响较弱。
3.4. Subchronic and chronic GBMs-exposure disrupts occludin and β-catenin expression patterns in HaCaT cells（GBMs亚慢性与慢性暴露破坏Occludin与β-Catenin表达模式）： 亚慢性及慢性GO暴露显著降低紧密连接蛋白Occludin膜定位；伴随E-Cadherin丢失，β-Catenin从膜脱落，亚慢性以胞浆蓄积为主，慢性则出现核转位（GO 1 5 μg/mL、GO 2、FLG 1 5 μg/mL核/质比显著升高），提示Wnt/β-Catenin通路可能参与EMT启动。
3.5. Graphene exposure remodels cytoskeletal intermediate filaments（石墨烯暴露重塑细胞骨架中间丝）： 亚慢性GO及部分FLG暴露引起角蛋白（Pan-Cytokeratin）下调与波形蛋白（Vimentin）上调；慢性暴露中GO 1与GO 2（及部分FLG）维持或加剧Vimentin升高、角蛋白降低趋势，体现上皮→间充质中间丝重组。
3.6. GBMs subchronic and chronic exposure induce functional changes in keratinocytes（GBMs亚慢性与慢性暴露诱导角质形成细胞功能性改变）： 荧光明胶降解实验示GO 1亚慢性及GO/FLG 1慢性暴露增强ECM降解能力；慢性暴露引起核面积/细胞面积比增大（核肿大）；GO 1与GO 2（5 μg/mL）亚慢性与慢性暴露提升克隆形成能力，FLGs无此效应；划痕实验未见典型梭形形态完全转变，提示为部分EMT（Partial EMT）状态。
3.7. GO 2 exposures recapitulate partial-EMT in mouse xenografts（GO 2暴露在小鼠异种移植中重现部分EMT表型）： HaCaT异种移植生长曲线显示GO 2组体积略大；组织学见GO组轻度纤维化倾向与GO聚集物残留。免疫荧光证实停药9周后GO 2异种移植上皮区E-Cadherin↓/N-Cadherin↑最显著，E-Cadherin/N-Cadherin荧光比值各GBM组均低于对照，慢性GO 2降幅最大；角蛋白减少与Vimentin增加也在慢性GO 2移植中被检出，证明体外诱导的EMT样上皮重塑可在体内微环境中存续。
讨论与结论翻译：
研究人员得出结论，长期低细胞毒性剂量GBMs——尤以高氧化度、较大横向尺寸的GO为著——通过亚慢性和慢性暴露重塑HaCaT细胞代谢，并诱导协调的上皮重塑包括钙黏蛋白转换、紧密连接Occludin丢失、β-Catenin核转位、角蛋白→波形蛋白中间丝重组、ECM降解增强及克隆形成增加，符合部分EMT样状态；该表型在裸小鼠异种移植中于末次暴露9周后仍可检测到。氧化度和横向尺寸是皮肤屏障水平GBMs慢性危害的关键理化决定因素。结合前期发现的持续DNA损伤，研究表明环境及职业相关浓度的长期低剂量氧化GBMs可在无非明显细胞毒性的情况下促进非致瘤皮肤细胞EMT样上皮可塑性与潜在促瘤特征，强调应将慢性低剂量终点纳入GBMs作为新兴污染物的环境与职业健康风险评估及Safe-by-Design策略中，并通过调控氧化态与横向尺寸降低慢性危害。
