WT1靶向口服长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）疫苗增强胰腺癌免疫检查点阻断疗效

《Advanced Science》：WT1-Targeted Oral Bifidobacterium longum Vaccine Enhances Checkpoint Blockade Efficacy in Pancreatic Cancer

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）对免疫检查点抑制剂（ICI）的反应性极低，这主要归因于其深度免疫抑制性的肿瘤微环境。为克服此耐药性，研究人员评估了一种口服WT1靶向肿瘤疫苗，该疫苗利用工程化重组长双歧杆菌菌株（B. longum 420）展示部分WT1抗原。口服B. longum 420免疫可激活WT1相关细胞免疫，增加IL-12产生的CD45+细胞及Th1/细胞毒性细胞因子产生型T细胞，并增强脾细胞对Pan02细胞的细胞毒活性。在同基因型Pan02肿瘤模型中，B. longum 420与抗PD-1及抗CTLA-4抗体联用较各单药治疗产生更强的抗肿瘤效应并改善生存，且未出现明显体重下降。空载体对照菌株未能进一步增强双检查点阻断的疗效。肿瘤分析显示，联合治疗组肿瘤内CD8+ T细胞密度增加，效应性、中枢记忆性及PD-1⁺ Ki-67⁺增殖性CD8+亚群扩增，同时肿瘤内CD4+ T细胞亚群组成亦呈治疗依赖性差异。这些发现表明，口服WT1靶向长双歧杆菌疫苗可增强PDAC中的双检查点阻断效应并促进更具免疫活性的T细胞景观。据研究人员所知，此为同基因型胰腺癌模型中该联合策略的首次报道。

胰腺导管腺癌（PDAC）是致死率最高的恶性肿瘤之一，五年生存率不足13%，尽管手术技术及化疗手段不断进步，患者预后仍极差，亟需开发新型治疗方法。免疫检查点抑制剂（ICI），特别是抗PD-1和抗CTLA-4抗体，虽已革新多种恶性肿瘤的治疗格局，但PDAC对ICI单药治疗反应有限，有效率通常低于5%。这种耐药性源于PDAC免疫抑制性肿瘤微环境的特征，包括致密促纤维结缔组织增生、T细胞浸润匮乏以及免疫抑制性细胞占优，形成所谓"冷肿瘤"表型。因此，增强肿瘤免疫原性并促进T细胞浸润的策略对提高PDAC中ICI疗效至关重要。

肿瘤疫苗是刺激肿瘤特异性T细胞浸润的有前景方法，其中WT1疫苗因WT1在包括PDAC在内的多种实体瘤中过表达且免疫原性高而备受关注。已有研究显示WT1靶向治疗策略（包括肽疫苗和树突状细胞疫苗）与化疗或其他免疫疗法联合时疗效增强，但尚未建立达到充分治疗效果的WT1肿瘤疫苗。此前，研究人员构建了展示部分小鼠WT1蛋白的重组长双歧杆菌（B. longum 420），并证实其可诱导多种WT1表位特异性细胞免疫，显著抑制WT1表达型小鼠前列腺癌、肾细胞癌及膀胱癌的肿瘤生长。鉴于约70%胰腺癌表达WT1蛋白，研究人员探索该WT1靶向口服疫苗平台能否克服PDAC的免疫治疗抵抗性，特别是与双检查点阻断联合应用时。

PDAC与此前研究中的肿瘤模型相比，代表了一种更为严格且难治的免疫治疗抵抗背景。其深度免疫抑制性肿瘤微环境、有限的T细胞浸润及促纤维结缔组织增生共同导致对ICI治疗反应不佳。因此，WT1靶向口服长双歧杆菌疫苗平台能否使PDAC对双检查点阻断敏感化并促进更具免疫活性的肿瘤微环境，尚属未知。该研究旨在评估口服肿瘤疫苗与对PDAC疗效有限的ICI联合能否增强治疗效果，研究人员评估了细胞因子产生、肿瘤浸润T细胞以及B. longum 420与抗PD-1和抗CTLA-4抗体联合的协同效应。

该研究主要关键技术方法如下：研究人员采用工程化重组长双歧杆菌B. longum 420菌株，通过穿梭载体电转化将部分鼠源WT1蛋白（氨基酸117–419）与半乳糖-N-二糖/乳糖-N-二糖I结合蛋白（GL-BP）融合表达并锚定于菌体表面，经65°C热灭活处理后口服给药；使用C57BL/6来源的小鼠PDAC细胞系Pan02建立同基因型皮下肿瘤模型，通过口服灌胃联合腹腔注射抗PD-1（RMP1-14克隆）和抗CTLA-4（9H10克隆）抗体进行治疗；采用流式细胞术进行 splenocytes 细胞内细胞因子染色、WT1四聚体染色及肿瘤浸润T细胞分析；运用乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性；通过免疫组织化学结合QuPath图像分析定量肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞密度。

研究结果部分，"B. longum 420诱导WT1相关免疫反应——胞内细胞因子染色与WT1四聚体染色检测"显示，B. longum 420免疫组中，IL-12产生细胞、CD4⁺ T细胞中IFN-γ和TNF-α产生细胞、CD8⁺ T细胞中Granzyme B、IFN-γ和TNF-α产生细胞均显著高于PBS组，CD69⁺细胞及IL-2产生细胞亦呈增加趋势，表明口服B. longum 420可激活WT1特异性细胞免疫。"B. longum 420增强针对Pan02细胞的CTL介导细胞毒活性"表明，免疫小鼠脾细胞对Pan02细胞的特异性裂解率在效靶比80:1和10:1时显著升高，证实疫苗诱导的免疫反应具有功能性细胞毒效应。"B. longum 420联合抗PD-1和抗CTLA-4抗体在Pan02小鼠PDAC模型中显示增强的抗肿瘤效应并改善生存"部分，联合治疗组至第31天时肿瘤生长较PBS组和ICI单药组显著受抑，B. longum 420单药组亦显著抑制肿瘤生长，Kaplan–Meier生存分析显示联合治疗组生存获益最大；WT1阴性对照菌株B. longum 2012未能增强双检查点阻断疗效，且各组均无显著体重下降，验证了抗原特异性。"Pan02肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞密度的免疫组化定量"显示，联合治疗组肿瘤内CD8⁺ T细胞密度高于其他组，而CD4⁺ T细胞密度在各组间变异较大，PBS组最高。"B. longum 420与ICI增加活化CD8⁺ T细胞浸润并改变肿瘤内CD4⁺ T细胞亚群组成"结果表明，联合治疗组不仅CD8⁺ T细胞比例增加，且CD44⁺CD62L^?效应性T细胞（T_eff）、CD44⁺CD62L⁺中枢记忆性T细胞（T_CM）及PD-1⁺ Ki-67⁺增殖性T细胞比例均显著升高；相反，PBS组CD4⁺ T细胞比例最高，且CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节性T细胞（Treg）和CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T-bet⁺ Th1-Treg细胞比例亦高于其他组，而PBS+ICI组CD4⁺FoxP3^?T-bet⁺ Th1细胞比例最高。

讨论部分，研究人员阐述了该研究的核心发现与意义。研究明确了口服肿瘤疫苗与ICI联合治疗胰腺癌的治疗价值，B. longum 420与抗PD-1及抗CTLA-4抗体联合治疗在小鼠PDAC模型中显著增强抗肿瘤活性，尽管B. longum 420单药具备 modest 抗肿瘤活性，但其疗效在与ICI联合时达到最大化。PDAC因免疫抑制性肿瘤微环境而对ICI单药高度抵抗，联合治疗克服此屏障具有临床意义。口服肿瘤疫苗诱导了稳健的WT1特异性细胞免疫反应，IFN-γ、IL-2、TNF-α及Granzyme B的产生增加，以及IL-12相关免疫轴的激活，均支持形成1型免疫微环境以促进细胞免疫。值得关注的是，联合治疗将免疫学"冷"的PDAC肿瘤微环境转向更具免疫活性的状态：免疫组化显示联合治疗组肿瘤内CD8⁺ T细胞密度升高，而流式分析揭示CD4⁺亚群组成的治疗依赖性变化——PBS组Treg和Th1-Treg富集提示免疫抑制性基线状态，PBS+ICI组Th1扩增单独存在但未能转化为有效CD8⁺介导的肿瘤控制，而联合治疗组则实现了CD8⁺ T细胞数量增加及T_eff、T_CM和PD-1⁺ Ki-67⁺ CD8⁺ T细胞的质性改变。PD-1⁺ Ki-67⁺ CD8⁺ T细胞的增加可能与早期治疗反应相关，而T_CM的增加提示长期免疫记忆形成的可能，有助于维持持久治疗效果。

研究结论部分指出，该研究证实了B. longum 420可在C57BL/6J小鼠中诱导WT1特异性T细胞反应，并进一步证实其与抗PD-1和抗CTLA-4抗体联合可诱导更多肿瘤浸润淋巴细胞。这些结果表明，与此前研究揭示的尿路上皮癌和前列腺癌类似，B. longum 420与ICI的联合治疗可能成为PDAC的有前景策略。该研究证明，口服WT1靶向肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂的联合代表了针对传统上抵抗免疫治疗的PDAC的有前景治疗策略，并为进一步的临床前优化和临床开发提供了充分依据。该论文发表于《Advanced Science》。