靶向GDF15–GFRAL轴的从头设计微型结合蛋白逆转癌症恶病质并恢复抗肿瘤免疫

《Advanced Science》：De Novo Designed Minibinders Targeting the GDF15–GFRAL Axis Reverse Cancer Cachexia and Restore Anti-Tumor Immunity

　　

癌症相关恶病质是一种毁灭性综合征，以进行性体重减轻、生存期缩短和对抗癌治疗反应受损为特征。生长分化因子15（GDF15）通过其受体GFRAL发挥作用，已成为恶病质的关键介质，然而有效且机制明确的策略来中和该通路仍然有限。在此，研究人员应用结构引导的从头蛋白设计，生成了选择性靶向GDF15–GFRAL相互作用界面的紧凑型微型结合蛋白。利用结合RFdiffusion、ProteinMPNN和AlphaFold 3结构预测的集成计算流程，研究人员设计并实验验证了具有皮摩尔级结合亲和力和优异结构稳定性的高亲和力GDF15微型结合蛋白。诱变和电荷互补拯救实验证实，这些微型结合蛋白通过精确设计的界面接触中和GDF15。在功能上，微型结合蛋白抑制GDF15–GFRAL信号传导，抑制下游转录反应，并在多个肿瘤模型中稳健地逆转体内恶病质，导致体重和生存期显著改善。重要的是，GDF15的中和还恢复了对抗PD-1免疫疗法的敏感性，在GDF15驱动的耐药肿瘤模型中。联合治疗增强了肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润和效应功能，其抗肿瘤疗效严格依赖于CD8⁺ T细胞。总之，这些发现表明，从头设计的GDF15微型结合蛋白能够在体内实现对GDF15–GFRAL轴的有效、机制明确的中和，转化为稳健的生理益处和免疫疗法疗效的恢复。

**论文解读文章：从头设计的微型结合蛋白靶向GDF15–GFRAL轴逆转癌症恶病质并恢复抗肿瘤免疫**

**研究背景**
生长分化因子15（GDF15）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，在细胞应激、组织损伤和疾病中强烈诱导表达。循环GDF15水平在癌症、心血管疾病、慢性炎症和代谢紊乱等多种病理状态下升高，并与疾病严重程度和不良临床结局相关。GDF15通过其受体GFRAL（主要表达于脑干最后区与孤束核）发挥作用，调节食欲、能量平衡和厌恶性信号。在癌症中，持续升高的GDF15导致厌食、体重减轻和代谢紊乱，成为癌症恶病质的关键特征。此外，GDF15还调节抗肿瘤免疫和治疗反应性。目前靶向GDF15–GFRAL轴的治疗策略主要依赖单克隆抗体（抗GDF15或抗GFRAL）以及GDF15类似物。尽管这些方法显示出临床前和早期临床潜力，但抗体存在分子大、组织穿透有限、靶向蛋白-蛋白相互作用界面灵活性不足等局限，且通常通过经验筛选而非结构引导的工程化优化。因此，亟需能够精确、机制化靶向GDF15信号的新型治疗模式。近年来，计算蛋白设计的进展（如RFdiffusion、ProteinMPNN和AlphaFold）使得从头生成与定义分子表面高亲和力、高特异性结合的小型蛋白成为可能。本研究应用结构引导的从头蛋白设计，生成直接靶向GDF15–GFRAL相互作用界面的微型结合蛋白，并评估其在癌症恶病质和免疫疗法中的潜力。

**主要技术方法**
研究人员采用结构引导的从头蛋白设计策略，利用RFdiffusion生成结合骨架，ProteinMPNN进行序列优化，AlphaFold 3评估结构预测质量。候选物经酵母表面展示筛选，结合流式细胞术分选富集。通过表面等离子体共振（SPR）测定结合动力学，圆二色光谱（CD）评估热稳定性。位点饱和诱变（SSM）和电荷互补拯救实验验证界面接触。体内实验使用C57BL/6和BALB/c小鼠（购自Charles River Laboratories），皮下接种MC38（结肠腺癌）、LLC1（Lewis肺癌）或A20（B细胞淋巴瘤）肿瘤细胞，其中部分肿瘤工程化表达人GDF15。治疗给予GDF15微型结合蛋白（10 mg/kg，每2天腹腔注射）和/或抗PD-1抗体（5 mg/kg，每周两次）。流式细胞术和免疫荧光分析肿瘤浸润CD8⁺ T细胞及其效应功能。

**研究结果**
**3.1 结构引导的从头设计靶向GDF15–GFRAL界面的微型结合蛋白**
通过结构分析GDF15–GFRAL复合物（PDB: 5VZ4），识别关键热点残基（S35、V87、V96），利用RFdiffusion生成骨架，ProteinMPNN设计序列，AlphaFold 3评估。另一策略采用BindCraft流程结合AlphaFold2多聚体预测。筛选标准包括pLDDT > 80、pAE_interaction < 10、ΔΔG ≤ ?30 kcal/mol。最终获得候选微型结合蛋白。

**3.2 计算筛选与高置信度GDF15微型结合蛋白的结构表征**
经多级过滤（二级结构复杂度、EsmFold单体pLDDT > 80、AlphaFold 3复合物pLDDT > 80且pAE < 10、能量ΔΔG < ?30），获得高置信度候选。前5名候选的平均pLDDT约90，pAE低，RMSD约1 ?。结构预测显示其与GDF15受体结合表面高度互补，序列分析显示核心区和界面残基保守。

**3.3 实验验证鉴定高亲和力GDF15微型结合蛋白**
酵母展示筛选富集出主导克隆（如05_41_14和05_25_1）。重组表达纯化后，SEC显示单体峰。SPR测定结合亲和力：05_41_14的K_D为2.5×10^?10 M，05_25_1为3.1×10^?10 M。AlphaFold 3预测结构显示RMSD约1 ?，PAE < 6，pLDDT > 90。CD光谱表明在高达95°C下保持稳定二级结构。

**3.4 从头设计的微型结合蛋白通过定义的界面接触竞争性阻断GDF15–GFRAL相互作用**
结构叠加显示微型结合蛋白占据GFRAL结合界面。ELISA竞争实验表明两个微型结合蛋白以低纳摩尔IC₅₀抑制GDF15活性，界面突变降低效力。位点饱和诱变热图显示GDF15和微型结合蛋白上的关键残基突变导致结合丧失。电荷互补拯救实验：GDF15 D102K突变与微型结合蛋白K16E突变分别降低抑制效力，而双突变组合部分恢复活性，证实静电接触特异性。

**3.5 微型结合蛋白介导的GDF15中和抑制下游信号并逆转体内癌症恶病质**
体外：GDF15刺激诱导ERK1/2磷酸化和即刻早期基因（FOS、JUN、EGR1）上调，微型结合蛋白（如ponsegromab抗体）显著抑制这些反应。SRE-荧光素酶报告系统验证依赖D102-K16静电界面的功能性中和。体内：MC38-hGDF15、LLC1-hGDF15和A20-hGDF15肿瘤模型小鼠出现进行性体重减轻、脂肪组织减少、肌肉萎缩和摄食减少，微型结合蛋白治疗显著改善体重、脂肪和肌肉质量、增加摄食，并延长生存期。

**3.6 GDF15中和通过CD8⁺ T细胞依赖机制恢复抗PD-1疗法敏感性**
MC38-hGDF15肿瘤对anti-PD-1单药治疗耐药，联合微型结合蛋白显著抑制肿瘤生长并延长生存。流式细胞术和免疫荧光显示联合治疗增强肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润，增加IFNγ⁺和GZMB⁺ CD8⁺ T细胞频率。CD8⁺ T细胞耗竭实验表明联合治疗获益严格依赖CD8⁺ T细胞。

**总结讨论**
研究结论：从头设计的GDF15微型结合蛋白通过精确工程化的界面接触实现高效、机制明确的GDF15–GFRAL轴中和，在多个肿瘤模型中逆转癌症恶病质，改善生理指标并提高生存率。此外，GDF15中和恢复对anti-PD-1免疫疗法的敏感性，其作用依赖于CD8⁺ T细胞的浸润与效应功能。这些发现揭示了基于结构设计的微型结合蛋白作为治疗癌症恶病质和增强免疫检查点阻断疗效的新型策略的潜力。论文发表在《Advanced Science》。