3D人骨和骨髓芯片模型用于体外骨重塑和免疫细胞维持

《Advanced Science》：A 3D Human Bone and Bone Marrow-on-a-Chip Model for In Vitro Bone Remodeling and Immune Cell Maintenance

　　

研究人员开发了一个人骨芯片（BOAC）模型，该模型在无异源、灌注环境中将自体原代免疫细胞和骨细胞整合到天然人骨基质上。与现有主要关注造血或基质区室的模型不同，本系统重现了功能性骨重塑的关键方面，并能够维持成熟免疫细胞（长达42天），在培养的特定时间点保持功能响应性。动态流动和顺序细胞接种促进了破骨细胞介导的骨吸收、成骨细胞驱动的基质形成，以及供体特异性免疫谱在延长培养期内的维持。通过受控温度调节进一步优化了骨细胞活性与免疫细胞持久性之间的平衡。BOAC模型保留了骨和骨髓生理学的关键特征，包括细胞外基质形成、可溶性因子信号传导和细胞异质性。骨支架来源于脱细胞人骨小梁，提供了生理相关的3D结构。单核RNA测序证实了主要供体特异性免疫细胞和骨细胞群体的存在。这个3D人体体外系统为转化研究和个性化医学提供了一个稳健的平台。

**论文解读：3D人骨和骨髓芯片模型实现体外骨重塑与免疫细胞维持**

**研究背景**
人骨髓（BM）是造血和免疫细胞维持的关键器官，其与相邻骨小梁构成动态相互作用微环境，通过骨重塑（由破骨细胞、成骨细胞和骨细胞调控）为造血干细胞分化提供分子信号，而骨髓细胞也反向调节骨代谢。然而，现有体外模型存在局限性：多数仅关注造血或基质区室，缺乏骨区室集成；或依赖合成支架、动物细胞，未能整合成人免疫细胞；且难以同时支持骨形成与骨吸收的平衡。因此，开发一个兼具生理性3D结构、细胞多样性、动态灌注及长期功能维持的人体骨-骨髓模型，是基础与转化研究中的迫切需求。

**研究目的与工作**
研究人员旨在构建一个生理相关的人体3D骨和骨髓芯片（BOAC）模型，以同步支持功能性骨重塑和成熟免疫细胞维持。该模型基于脱细胞人松质骨支架，采用自体原代间充质基质细胞（MSCs）、成骨细胞（OBs）、破骨细胞（OCs）及骨髓单个核细胞（BMMNCs）或外周血单个核细胞（PBMCs），在无异源、灌注的微流控环境中进行顺序接种和培养。通过优化动态流动、细胞接种顺序及培养温度，研究人员评估了骨重塑标志物、免疫细胞亚群分布及功能响应性，并利用单核RNA测序（snRNA-seq）和细胞因子谱分析验证了系统的生理相关性。

**主要关键技术方法**
1. **微流控动态培养系统**：使用HUMIMIC Chip2平台（TissUse GmbH），提供单向脉动流（平均流速6.3±0.8 μL/min），模拟骨髓间质液流动。
2. **脱细胞人松质骨支架**：来自Charité Universit?tsmedizin Berlin组织库，保留天然骨小梁结构（BV/TV 21.1±0.8%，孔隙率78.9±0.8%，小梁厚度166.6±4.7 μm）。
3. **顺序细胞接种策略**：先接种单核细胞分化为OCs（14天），再添加MSCs/OBs进行成骨分化（14天），最后引入BMMNCs或PBMCs维持14天。
4. **单核RNA测序（snRNA-seq）**：对6周培养后的BOAC样本与供体匹配的离体活检组织进行单核转录组分析，鉴定14个细胞类型簇。
5. **多重免疫分析**：采用Meso Scale Discovery（MSD）U-PLEX检测16种可溶性因子，并通过Ella系统定量T细胞相关细胞因子。

**研究结果**

**2.1 动态流动改善骨组织活性和免疫细胞维持**
动态培养条件下，人股骨头活检组织的骨特异性碱性磷酸酶（BALP）分泌显著升高（day 14: 365 pg/mL vs 静态77 pg/mL），磷酸盐水平稳定，而C端I型胶原端肽（CTX-I）缓慢下降，乳酸脱氢酶（LDH）释放较低。动态培养还维持了更高数量的免疫细胞（day 14: 2.74×10⁶ vs 静态1.61×10⁶），并保留B细胞、T细胞和单核细胞的比例。经Con A刺激后，动态培养的T细胞相关细胞因子（IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-5、TNF-α）在day 7显著高于静态培养，表明免疫功能得以维持。

**2.2 优化分化方案实现2D成骨基质沉积和骨吸收**
MSCs与OBs以75:25比例混合时，矿化基质沉积和BALP活性最高。骨髓来源单核细胞经21天刺激可形成成熟OCs（肌动蛋白环和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性），并在骨片上产生吸收陷窝（CTX-I释放和μCT成像证实）。

**2.3 2D共培养实验确定最佳接种顺序**
间接共培养显示，MSC/OB条件培养基抑制OC吸收陷窝形成，而OC条件培养基促进MSC/OB矿化基质沉积（约3倍增加）。直接共培养中，先分化OCs（OC-OM顺序）比先分化MSC/OBs（OM-OC顺序）产生更高的CTX-I浓度（175 nm vs 50 nm）和更大的吸收面积，且矿化与吸收均优于单培养。

**2.4 培养温度关键影响骨吸收和成骨活性**
37°C相比33°C促进了OCs增大和活性增强（更多吸收陷窝、更高CTX-I），且仅在37°C观察到矿化基质形成。因此，骨细胞分化阶段采用37°C，免疫细胞维持阶段切换至33°C。

**2.5 动态流动促进3D BOAC单培养中的免疫细胞维持和骨重塑标志物**
在3D脱细胞支架上，动态MSC/OB培养显著上调细胞外基质基因（骨粘连蛋白、核心蛋白聚糖、I型胶原、III型胶原），且OC单培养中CTX-I持续升高至42天，LDH释放低于静态。动态培养的BMMNCs维持了更接近基线（day 0）的免疫细胞亚群分布，且Con A刺激后细胞因子水平更高。

**2.6 BOAC模型整合活性吸收、成骨基质形成和免疫细胞维持**
在5周动态培养中，37°C条件下CTX-I峰值达30 nm（33°C仅6 nm），BALP和磷酸盐峰值更早更高。LDH始终低于细胞毒性阈值。FACS分析显示BMMNCs在33°C下T细胞短暂上升后恢复，B细胞略有减少，单核细胞稳定。

**2.7 网状组织早期形成，软组织在长期培养中成熟**
第14天H&E染色显示BOAC培养中骨小梁间出现网状组织；第28天可见基质细胞排列（F-actin、RUNX2表达）；第34天同步辐射μCT显示软组织样结构扩展。

**2.8 BOAC培养的可溶性环境和细胞组成与离体活检相似**
长期培养中促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ）稳定，骨形成标志物骨桥蛋白（OPN）和骨保护素（OPG）升高，M-CSF下降，VEGF-A增加。主成分分析（PCA）表明BOAC培养第42天的可溶性因子谱与供体匹配的离体活检重叠，其中PB-BOAC更接近。snRNA-seq鉴定出14个细胞簇，包括OB样细胞、OC样髓系细胞和淋巴样细胞（T、B细胞），与离体活检有广泛重叠，但红细胞、内皮细胞和早期B细胞缺失。

**总结与讨论**
本研究构建的BOAC模型满足理想骨髓模型的关键要求：无异源3D微结构、动态灌注、细胞多样性及多级细胞分化。通过使用天然人松质骨支架和自体原代细胞，该模型在单一平台中同时支持破骨细胞介导的吸收、成骨细胞驱动的基质沉积、免疫细胞维持及稳态可溶性环境。温度顺序调控（37°C→33°C）和顺序接种策略（OC-OM）是实现功能骨重塑和免疫细胞长期存活的核心。与现有模型相比，BOAC保留了成人免疫细胞的复杂性（包括记忆T/B细胞）和功能响应性，并形成网状结缔组织，具有重要的转化潜力。然而，模型缺乏内皮细胞、早期B细胞和红细胞，提示造血和血管复杂度尚不完全。未来可通过集成iPSC衍生细胞、机械刺激和血管化模块进一步优化。该模型为个性化医学、骨疾病（如骨质疏松、多发性骨髓瘤）和年龄相关免疫功能障碍的研究提供了稳健的体外平台。

**研究结论（翻译原文结论部分）**
"本系统的生理相关性通过使用人松质骨支架和自体原代细胞得到增强。人骨结构的复杂性至今无法合成复制，但天然骨基质与最小程度扩增的骨髓前体细胞共同实现了体外组织自组装。研究人员观察到网状软组织形成、活跃的骨代谢以及促进稳态的可溶性环境，而未见过度骨吸收、炎症或细胞死亡。尽管存在局限性，但其模块化架构允许灵活适应不同的研究问题和临床适应症。未来工作将聚焦于使用iPSC衍生细胞适配系统，这将实现基因改造，并将系统适用性扩展到骨硬化症等先天性疾病和其他罕见病。"