钴单原子纳米酶通过双向活性氧调控增强肠道辐射防护和肿瘤放射增敏

《Advanced Science》：Cobalt Single-Atom Nanozyme for Enhanced Intestinal Radioprotection and Tumor Radiosensitization via Bidirectional ROS Modulation

本文中，研究人员开发了一种口服给药的钴单原子纳米酶（Co-SAN），其具有pH响应的双功能催化活性，能够同时实现肠道辐射防护和肿瘤放射增敏。在碱性肠道微环境中，Co-SAN有效清除辐射诱导的活性氧（ROS）（经流式细胞术验证），从而减轻辐射诱导的肠道损伤（RIII）。机制上，RNA测序分析表明，除了直接清除ROS外，Co-SAN下调了ROS介导的PI3K/AKT信号通路，显著抑制了有害的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。此外，这种高生物相容性的纳米酶维持了肠道微生物群稳态并保护了肠道屏障完整性。相反，在微酸性肿瘤微环境（TME）中，Co-SAN发生催化转换，促进ROS生成并改善缺氧，从而有力增强放射治疗功效。总之，本研究提出了一种双功能单原子纳米酶，解决了正常组织保护与靶向肿瘤增敏之间的空间矛盾，为大幅拓宽放疗的治疗窗口提供了有前景的新范式。

**研究背景、问题与意义**
放射治疗（RT）是恶性肿瘤治疗的核心手段之一，通过直接破坏生物大分子和间接通过活性氧（ROS）诱导氧化损伤来杀死肿瘤细胞。然而，由于肿瘤固有的异质性，特别是乏氧微环境导致肿瘤对辐射抵抗，使放疗疗效受限。为了提高肿瘤控制率而增加电离辐射（IR）剂量，不可避免地会对邻近正常组织造成不可逆损伤，尤其肠道对辐射高度敏感，辐射诱导的肠道损伤（RIII）严重影响患者预后和生活质量。目前临床上唯一获批的辐射防护剂氨磷汀（AMF）虽能减轻肠道损伤，但需静脉注射且全身毒性显著；其他小分子抗氧化剂如维生素E和虾青素因水溶性差、半衰期短而难以口服。更重要的是，非选择性ROS清除在保护肠道的同时会中和肿瘤内所需的氧化应激，这是一个关键取舍问题。因此，亟需开发稳定、可口服且具有选择性保护机制的新型辐射防护剂。单原子纳米酶（SANs）凭借明确的原子分散活性位点、优异催化活性、高稳定性和低成本而备受关注，但构建随生物微环境动态变化而具有不同酶活性的双功能SANs并阐明其体内作用机制仍是巨大挑战。本研究报道了一种口服、pH响应的钴单原子纳米酶（Co-SAN），在碱性肠道环境中发挥抗氧化酶活性清除ROS，保护肠道；在酸性肿瘤微环境中转换为促氧化酶活性，增敏放疗。机制研究发现Co-SAN通过清除ROS抑制PI3K/AKT信号通路，减少有害的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成，从而保护肠道。该研究为同时实现正常组织防护和肿瘤增敏提供了新范式，论文发表在《Advanced Science》。

**主要关键技术与方法**
研究人员合成Co-SAN采用ZnCo-MOF前驱体的高温热解策略。通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、X射线吸收精细结构（XAFS）及波变换（WT）等系统表征其原子级分散的Co-N₄结构。酶活性评估通过ABTS/DPPH自由基清除、过氧化氢分解、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、氧化酶（OXD）、过氧化物酶（POD）、NAD(P)H氧化酶（NOX）和谷胱甘肽氧化酶（GSHOx）等实验及密度泛函理论（DFT）计算。体内实验使用C57BL/6J小鼠建立急性辐射损伤模型和结直肠肿瘤模型，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量转录组测序、16S rRNA基因测序和粪便非靶向代谢组学分析机制；Western blot和免疫荧光验证信号通路。样本来源：小鼠为C57BL/6J品系，肿瘤细胞系为CT-26（结直肠癌细胞），正常细胞系为IEC-6（小肠上皮细胞）和NCM460（人正常结肠上皮细胞）。

**研究结果**
**2.1 Co-SAN的合成与表征**
成功通过热解ZnCo-MOF前驱体获得Co-SAN，保持十二面体形貌。HAADF-STEM和元素映射证实Co以单原子形式均匀分散于碳基质，Co载量2.57 wt.%。XAFS和EXAFS拟合表明Co以+2价态存在，主要配位结构为吡啶型Co-N₄，无Co纳米颗粒。

**2.2 Co-SAN的酶模拟活性**
Co-SAN在碱性条件下展现出CAT、SOD和GPx样活性，高效清除H₂O₂和O₂^•?；在酸性条件下（pH<7）展现出OXD、POD、NOX和GSHOx样活性，促进ROS生成并消耗GSH。DFT计算揭示了pH依赖性机制：碱性环境下SOD活化能垒降低，酸性环境下OXD/POD反应热力学更有利。Michaelis-Menten动力学分析显示Co-SAN具有优异底物亲和力和催化效率。

**2.3 体外辐射防护**
在IEC-6细胞中，Co-SAN无细胞毒性。γ-H2AX免疫荧光显示Co-SAN显著减少DNA双链断裂。克隆形成实验表明Co-SAN保护IEC-6细胞免受辐射损伤，但对CT-26肿瘤细胞无保护作用。DCF染色和流式细胞术证实Co-SAN高效清除辐射诱导的ROS。

**2.4 口服Co-SAN保护体内辐射诱导损伤**
Co-SAN在模拟胃液和肠液中稳定，口服后在小鼠肠道内滞留长达12小时。在16 Gy腹部X射线照射模型中，Co-SAN预防给药显著改善体重下降、延长生存期、恢复结肠长度，降低肠道ROS水平。HE染色显示小肠绒毛结构和长度接近正常，PAS染色保护杯状细胞，免疫荧光（IF）显示紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-3）表达恢复，γ-H2AX和TUNEL阳性细胞减少，CD206表达提示免疫微环境改善，ELISA检测显示促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）下调。

**2.5 口服Co-SAN与AMF比较**
与临床药物氨磷汀（AMF）相比，Co-SAN在体重、生存率、结肠长度恢复、小肠组织学评分及紧密连接蛋白表达方面相当或略优。且Co-SAN可口服，克服了AMF需注射和全身毒性的限制。

**2.6 Co-SAN影响辐射诱导的中性粒细胞募集和NETs形成**
单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示巨噬细胞和中性粒细胞是RIII的主要效应细胞。中性粒细胞GO富集显示NETs形成和炎症相关通路显著上调。批量转录组测序显示Co-SAN下调中性粒细胞趋化因子基因及TNF、NF-κB通路。流式细胞术证实Co-SAN减少辐射诱导的中性粒细胞募集。免疫荧光共定位MPO/CitH3表明Co-SAN抑制NETs形成，且与公开数据集GSE145131结果一致。

**2.7 Co-SAN预防辐射损伤的分子机制**
KEGG和GSEA分析显示Co-SAN抑制PI3K/AKT通路。Western blot和免疫荧光证实Co-SAN及PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K/AKT磷酸化和NETs形成；AKT激动剂SC79可逆转Co-SAN的作用。scRNA-seq显示辐射驱动中性粒细胞向终末NETs亚群分化，Co-SAN阻止该转变。体内实验：Co-SAN单药与Co-SAN联合LY294002效果相当，表明Co-SAN已饱和抑制该通路。

**2.8 Co-SAN在荷瘤条件下保护正常肠道组织**
在CT-26结直肠癌模型中，Co-SAN口服联合X射线照射显著延长荷瘤小鼠生存期，同时保护结肠长度和肠道组织学结构。分次放疗（5 Gy × 3）进一步证实Co-SAN对肿瘤无保护作用，反而增敏放疗。肿瘤内ROS和CD8⁺ T细胞浸润及效应因子（GZMB、IFN-γ、TNF-α）显著增加，HIF-1α和CA9表达降低，表明Co-SAN缓解乏氧并增强抗肿瘤免疫。药代动力学显示Co-SAN肿瘤蓄积达峰值3.51 μg/g。

**2.9 对肠道菌群的保护作用**
16S rRNA测序显示辐射导致菌群紊乱（Bacteroidetes和Actinobacteria减少，γ-Proteobacteria增加），Co-SAN维持菌群结构接近正常，恢复α多样性和β多样性，增加Lactobacillus、Muribaculaceae等有益菌丰度。粪便非靶向代谢组学表明Co-SAN富集抗炎代谢物（Citrumarin A等），抑制脂质过氧化和促炎代谢物，上调胆固醇代谢、胆汁分泌、TCA循环及氨基酸代谢通路，抑制mTOR和鞘脂信号。

**2.10 长期安全性**
连续口服60天后，Co-SAN不引起体重下降，主要脏器HE染色无异常，肝肾功能（ALT、UREA）和血常规指标（RBC、WBC、Lym、Neu）均正常范围，显示优异生物相容性。

**总结与讨论**
研究结论部分（源自原文Conclusion）翻译如下：总之，研究人员成功建立了一种口服给药的Co-SAN，能够响应生物微环境pH值模拟不同酶活性，突破了腹部/盆腔肿瘤放疗与辐射防护之间矛盾的挑战。Co-SAN在肠道环境中表现出良好的CAT、SOD、GPx催化活性，通过卓越的ROS清除能力显著缓解氧化应激，保护正常肠道免受辐射损伤。同时，Co-SAN在肿瘤微环境中利用CAT、OXD、NOX和GSHOx活性，能够缓解肿瘤乏氧并产生ROS，提高腹部/盆腔肿瘤放疗疗效。全面的体内外评估强力验证了这一双治疗范式，展示了优异的生物相容性以及同时实现肿瘤放射增敏和正常组织辐射防护。机制上，多组学结合体内外实验揭示，Co-SAN介导的ROS清除抑制了PI3K/AKT信号通路的过度活化，进而阻断致病性NETs形成。这一发现阐明了NETosis在驱动继发性辐射诱导组织损伤中的关键作用。最终，本研究为智能单原子纳米疗法提供了令人信服的理性设计，为扩大临床放疗治疗窗口提供了一个高度可转化的策略。