胸腺来源的富IL-7R细胞外囊泡通过促进中性粒细胞胞外诱捕网形成加重结肠炎

《Advanced Science》：IL-7R-Enriched Extracellular Vesicles From the Thymus Drive Colitis via Promoting Neutrophil Extracellular Trap Formation

　　

越来越多的证据表明肠外器官参与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）进展，但肠道—肠外器官间串扰的机制仍不清楚。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是器官间通讯的关键介质。本研究发现，结肠炎小鼠循环EVs通过诱导中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）形成加重结肠炎严重程度。抑制循环EV分泌或NET形成可缓解结肠炎。机制上，富白细胞介素?7受体（interleukin?7 receptor，IL?7R）的EVs被鉴定为NET介导结肠炎恶化的关键驱动因子。下调IL?7R减轻结肠炎症状，而上调IL?7R则恶化疾病进程。研究发现IL?7R通过蛋白精氨酸脱亚胺酶4（protein?arginine deiminase type 4，PAD4）通路诱导NETs从而加重结肠炎。此外，本研究确定胸腺源性EVs是循环中富IL?7R EVs的主要来源。结肠炎期间，升高的循环脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激胸腺释放富IL?7R EVs，后者经胸腺?肠道轴迁移至结肠并促进结肠组织NET形成。本研究揭示了IBD发病中一条此前未被认识的、由富IL?7R EVs介导的胸腺?肠道通讯轴，并为IBD好发于儿童及青少年提供了部分解释。靶向该轴可为IBD管理提供新的治疗策略。

论文解读：《胸腺来源的富IL?7R细胞外囊泡通过促进中性粒细胞胞外诱捕网形成加重结肠炎》

该研究发表于《Advanced Science》。

一、研究背景与立项依据

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD，包括溃疡性结肠炎 ulcerative colitis，UC和克罗恩病 Crohn's disease，CD）以慢性肠道炎症、菌群失调及屏障功能受损为特征，现有治疗主要针对症状缓解而非纠正黏膜愈合或肠外器官串扰机制。IBD被认为是由脑?肠轴、肝?肠轴、口?肠轴等多器官交互调控的系统性疾病，但介导肠道?肠外器官通讯的分子介质尚不明确。胸腺是T细胞发育与免疫稳态的中枢器官，IBD高发于10～29岁青少年，恰与胸腺开始退变时期重合，提示胸腺可能参与IBD发病。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）作为纳米级信使可运输脂质、核酸及蛋白介导器官间通讯；中性粒细胞通过释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）参与IBD炎症，但其诱导机制未明。白细胞介素?7受体（interleukin?7 receptor，IL?7R）对淋巴发育至关重要且在IBD抗TNF治疗反应中有临床关联，但其在结肠炎中的功能作用未知。基于此，研究人员假设胸腺源性富IL?7R EVs经胸腺?肠道轴诱导结肠NET形成从而加重IBD，并开展本研究验证。

二、主要关键技术方法

研究人员收集健康志愿者、UC及CD患者血浆样本分离EVs，并以DSS（dextran sulfate sodium，分子量36～50 kDa）诱导C57BL/6小鼠急性结肠炎模型，部分实验采用裸鼠（Nude mice）、Padi4基因敲除（PAD4?KO）小鼠；分离胸腺源性EVs（thymus?derived EVs，TD?EVs）。EVs经差速超速离心法分离，透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）和纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）鉴定形态与粒径，Western blot检测标志物TSG101、CD9、CD81及内质网标志Calnexin以排除细胞污染。骨髓分离小鼠原代中性粒细胞经Percoll密度梯度离心及CD11b⁺Ly?6G⁺磁珠分选纯化。干预手段包括EV分泌抑制剂GW4869、抗Ly?6G抗体清除中性粒细胞、DNase I降解NETs、抗IL?7R抗体或重组小鼠IL?7R蛋白调节IL?7R水平、尾静脉注射LPS或抗TLR4（Toll?like receptor 4）阻断抗体。EV体内示踪采用DiR荧光标记后活体成像；NET形成以SYTOX Green与瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，H3cit）共染色判定；血清及胸腺LPS定量用ELISA；IL?7R水平用Western blot及纳米流式检测；组织学评分基于H&E及AB?PAS染色；qRT?PCR检测炎症因子及信号分子mRNA；统计学采用t检验或单因素方差分析。

三、研究结果

2.1 Circulating EVs From Colitis Induce NET Formation

研究人员从健康人（Normal?EVs）、UC及CD患者血浆分离EVs，TEM显示典型杯状形貌、NTA粒径30～200 nm，Western blot证实TSG101、CD9、CD81阳性且Calnexin阴性。UC?EVs和CD?EVs浓度显著高于正常对照，可被中性粒细胞内化并强烈诱导NET形成。小鼠尾静脉注射DiR标记的DSS结肠炎小鼠血浆EVs（DiR?DSS?EVs），24 h后于结肠、肝、脾富集。IBD患者及DSS结肠炎小鼠结肠组织可见明显中性粒细胞浸润及NET（MPO与H3cit共定位）增加。表明循环EVs可迁移至结肠并触发NETosis。

2.2 Inhibition of EV Secretion Downregulates Colonic NET Formation and Alleviates Experimental Colitis in Mice

给予DSS结肠炎小鼠EV生物合成抑制剂GW4869后，结肠中性粒细胞招募及NET形成显著减少，NETosis相关分子（IRAK4、RIPK1、RIPK3、PI3K、mTOR、MAPK、PAD4）表达下调。GW4869本身不直接影响中性粒细胞NET形成。表型上，GW4869处理减轻体重丢失、降低疾病活动指数（disease activity index，DAI）、延长结肠、改善大体及组织学损伤评分、减少杯状细胞丢失并下调IL?17A、TNF?α、IL?1β、TGF?β1表达。表明阻断EV分泌可抑制结肠NET形成并缓解实验性结肠炎。

2.3 Promotion of NET Formation Is the Key Mechanism by Which Circulating Extracellular Vesicles Exacerbate Colitis

以抗Ly?6G抗体耗竭中性粒细胞或腹腔注射DNase I降解NETs均显著减轻DSS结肠炎小鼠体重下降、DAI升高、结肠短缩、大体及组织学损伤和炎症因子表达。证明循环EVs主要通过诱导NET形成而非其他中性粒细胞功能加重结肠炎。

2.4 Plasma?Derived EVs of Colitis Are Enriched With IL?7R and Induce Colonic NET Formation Through IL?7R

UC及CD患者血浆EVs中IL?7R蛋白水平显著高于健康人，且血浆中IL?7R主要富集于EVs组分。体外用抗IL?7R抗体中和UC/CD?EVs中IL?7R可抑制其诱导的NET形成，外源添加重组IL?7R则增强之。IBD患者结肠黏膜IL?7与IL?7R表达升高；DSS小鼠结肠IL?7R上调且GW4869抑制EV分泌后结肠IL?7R降低，提示结肠IL?7R部分源自循环EVs。IL?7R直接促进中性粒细胞NET形成及PMA诱导的NETosis；体内下调IL?7R减轻、上调加重结肠中性粒细胞浸润与NET形成及PAD4/RIPK3/mTOR表达。表明结肠炎血浆EVs富载IL?7R并通过IL?7R驱动结肠NETosis。

2.5 IL?7R Exacerbates the Severity of Experimental DSS?Induced Colitis

DSS模型中抗IL?7R抗体处理减轻体重丢失、DAI、结肠短缩、大体及组织学损伤、杯状细胞丢失和促炎因子表达；重组IL?7R蛋白则恶化上述指标，证实循环EV递送的IL?7R与IBD严重程度密切相关。

2.6 IL?7R Induces NETs via the PAD4 Pathway to Aggravate Colitis

抑制EV分泌降低、IL?7R过表达升高结肠PAD4表达；IL?7R刺激上调中性粒细胞PAD4 mRNA。PAD4?KO DSS结肠炎小鼠NET形成少于野生型，且外源IL?7R蛋白无法在PAD4?KO小鼠中增加NET形成或改变疾病表型（体重、DAI、结肠长度、组织学等）。表明IL?7R经PAD4依赖途径诱导NETosis并加重结肠炎。

2.7 The Thymus Is the Primary Source of Circulating IL?7R?Enriched EVs

各组织中胸腺IL?7R表达最高且在结肠炎时上调；无胸腺裸鼠结肠炎时血清EVs IL?7R水平低于正常C57BL/6结肠炎小鼠。人胸腺组织亦表达IL?7R。分离的正常及DSS结肠炎小鼠胸腺源性EVs（TD?EVs?Normal / TD?EVs?Colitis），后者IL?7R显著富集且高于其他器官来源EVs。结肠炎小鼠血清及胸腺LPS升高，尾静脉LPS刺激特异性上调胸腺IL?7R并包装入TD?EVs（TD?EVs?LPS），该过程可被抗TLR4抗体阻断。DiR标记的TD?EVs?Colitis与TD?EVs?LPS静脉注入后可聚集于结肠并被中性粒细胞内化，强效诱导NET形成且该诱导可被抗IL?7R抗体中和。结论：胸腺是循环富IL?7R EVs主要来源，结肠炎时肠道LPS经血刺激胸腺高表达IL?7R并包装入TD?EVs，后者经胸腺?肠道轴至结肠驱动NET形成加重炎症。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出，IBD现行疗法响应率有限且忽视肠外器官贡献，本研究首次揭示胸腺作为IBD肠外效应器，通过释放富IL?7R EVs经胸腺?肠道轴至结肠诱导PAD4依赖的NETosis从而加重炎症，解释了IBD好发青少年与胸腺退变期的关联。循环富IL?7R EVs有望成为IBD诊断血液生物标志物及治疗靶点，抑制EV分泌、阻断IL?7R或降解NETs具潜在治疗价值。局限性在于胸腺?肠道轴主要基于动物模型，需进一步在人IBD中验证，并建议构建胸腺特异性IL?7R敲除模型确证因果。

研究结论（翻译）： 本研究表明结肠炎时产生的LPS进入循环到达胸腺，刺激IL?7R表达并将富IL?7R EVs释放入血，经胸腺?肠道轴转运至结肠诱导PAD4依赖的NET形成从而加剧肠道炎症，揭示了IBD中此前未被认识的胸腺?肠道通讯轴，靶向IL?7R、EVs或NETs可为IBD提供新治疗思路。