分子工程策略精细调控AIE探针光毒性用于线粒体嵴动态超分辨率成像

《Advanced Science》：A Molecular Engineering Strategy to Fine-Tune Phototoxicity of AIE Probes for Super-Resolution Imaging of Mitochondrial Cristae Dynamics

　　

理解线粒体形态和功能对于研究线粒体疾病至关重要，然而，能够标记线粒体内膜（inner mitochondrial membrane, IMM）并以高时空分辨率报告功能障碍的荧光探针仍然有限。在此，研究人员理性设计了具有可调烷基链长度和羧基的聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）活性探针，从而能够精细调控光毒性，并实现可控的、温和水平的活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成。两种分别命名为OTS-7C和OTS-12C的探针，利用受激发射损耗显微镜（stimulated emission depletion microscopy, STED）实现了线粒体嵴的超分辨率成像，而OTS-12C还进一步支持在活细胞中进行Hessian结构光照明显微镜（Hessian-structured illumination microscopy, Hessian-SIM）成像。重要的是，OTS-12C的可控ROS输出支持对线粒体应激反应（包括肿胀、嵴重塑和恢复）进行长时间延时成像。研究人员进一步证明了它可以作为评估抗氧化剂效果的平台，使用维生素C和虾青素作为模型抗氧化剂。同时，OTS-12C的荧光寿命成像（fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）显示，ROS诱导的不饱和脂质氧化增加了其在IMM内的荧光寿命，从而实现了对线粒体功能状态的实时监测。这项工作提出了一种简单而有效的策略来精细调控AIE光敏剂的光毒性，并提供了OTS-12C作为一种多功能荧光探针，用于线粒体超微结构的高分辨率可视化、研究线粒体应激管理以及评估活细胞中药物抗氧化功效。

**论文解读文章**

**研究背景与问题提出**

线粒体是细胞中ATP合成的主要场所，也是细胞信号转导的中枢，调控包括凋亡、自噬、钙稳态、干细胞分化和免疫应答等多种基本细胞过程。其结构特征为双层膜架构，包括线粒体外膜（OMM）和线粒体内膜（IMM），其中IMM由内边界膜和高折叠的嵴组成，以最大化表面积容纳氧化呼吸所需的分子机器。传统上，透射电子显微镜（TEM）因其卓越的空间分辨率而被视为解析线粒体膜超微结构的金标准，但其需要对样品进行固定和切片，无法实现对活细胞中动态过程的实时观察。近期，活细胞兼容的超分辨率（SR）显微镜技术，如受激发射损耗显微镜（STED）和结构光照明显微镜（SIM），为研究线粒体动力学提供了新机遇。然而，SR成像高度依赖荧光团的最佳光物理性质，且成像过程中荧光激发可产生活性氧（ROS），导致线粒体应激并可能激活凋亡通路。现有策略如三线态工程（利用环辛四烯COT）虽能改善性能但合成复杂，或使用9,9-二甲基-9,10-二氢吖啶（DMA）可增强光稳定性但未能清晰显示嵴。关键是，以往研究主要关注最小化光毒性以保持样品完整性，而对线粒体嵴在ROS响应下的动态变化了解有限。因此，需要平衡ROS刺激强度与成像性能，以实现对嵴动力学的有效观察。本研究提出一种分子设计策略，通过引入羧基（COOH）和调节聚集诱导系间窜越（AI-ISC）来精细调控光毒性，从而产生可控的温和ROS作为内置刺激，研究活细胞中线粒体结构对氧化应激的响应。该论文发表在《Advanced Science》。

**主要关键技术与方法**

本研究采用的关键技术方法包括：1）基于密度泛函理论（DFT）的量子化学计算，评估单重态-三重态能隙（ΔE_S-T）和自旋-轨道耦合（SOC）值；2）动态光散射（DLS）和扫描电子显微镜（SEM）分析探针的粒径与聚集形态；3）通过DCFH（通用ROS）、ABDA（单线态氧¹O₂）和HPF（羟基自由基•OH）指示剂定量ROS生成效率；4）使用受激发射损耗显微镜（STED）和Hessian结构光照明显微镜（Hessian-SIM）进行超分辨率成像；5）荧光寿命成像显微镜（FLIM）监测线粒体微环境变化；6）使用维生素C和虾青素进行抗氧化剂预处理实验。细胞来源包括HeLa（宫颈癌细胞系）、U2OS（骨肉瘤细胞系）和NIH/3T3（正常成纤维细胞系）。

**研究结果**

**2.1 分子设计调节光毒性**

在已报道的IQ-TPA探针（具有大斯托克斯位移、高光稳定性和线粒体靶向性）基础上，研究人员采用“逐步”分子优化策略：引入甲氧基增强分子内电荷转移（ICT），并用噻吩单元替代异喹啉的稠合苯环以延长π共轭骨架；随后引入亲水性羧基和不同长度烷基链以调节聚集性质。这些衍生物通过铑催化的简单一锅多组分反应合成。

**2.2 光物理性质与ROS生成效率**

OTS-4C、OTS-7C和OTS-12C在纯DMSO中吸收峰相似（462-465 nm），而在99%水中的发射峰逐渐红移（634-652 nm）。随水含量增加，荧光强度增强，OTS-12C在90%水溶液中荧光增强42倍，OTS-7C约25倍，OTS-4C约8倍，确认了典型的AIE行为。总ROS检测显示OTS生成最快，OTS-12C、OTS-7C、OTS-4C依次降低；单线态氧检测中所有含羧基探针均低于Rose Bengal；羟基自由基检测显示OTS最强，OTS-12C次之，OTS-7C和OTS-4C最低。说明羧基优先抑制了Type-I ROS生成。

**2.3 ROS生成效率调节的机理研究**

理论计算表明，羧基对ΔE_S-T影响可忽略，但显著降低SOC值，且短烷基链衍生物降低更明显。动态光散射显示亲水性更强的OTS-4C粒径最大（143.06 nm），OTS-7C（119.17 nm）和OTS-12C（120.09 nm）较小，暗示较紧密堆积。荧光寿命测量显示，在聚集态下OTS-12C寿命最长（0.85 ns），OTS-7C（0.72 ns），OTS-4C（0.76 ns）。结合AI-ISC原理，短烷基链倾向于松散堆积和较低ROS生成。两种机制协同作用：羧基提供基线SOC抑制，链长依赖性堆积精细调节AI-ISC贡献。

**2.4 细胞光毒性与光稳定性**

CCK-8实验表明，无光照时5 μM探针处理HeLa细胞24 h无明显细胞毒性；脉冲处理（1 h加24 h孵育）后10 μM OTS-12C仍保持>90%活性。共定位显示OTS-4C主要标记质膜，OTS-7C和OTS-12C特异性靶向线粒体。光照细胞毒性实验显示，OTS处理5 min即导致大量死亡，20 min后近90%死亡；而OTS-4C、OTS-7C和OTS-12C在5 min光照后保持高活性，20 min后仅10%、10%和20%死亡。光稳定性实验显示，MitoTracker Green在100次扫描后荧光损失>95%，而OTS-7C和OTS-12C分别保留90%和70%初始信号。

**2.5 线粒体超分辨率成像**

OTS-7C和OTS-12C与488 nm激发和775 nm STED损耗光兼容。在HeLa细胞中，STED图像清晰显示线粒体嵴的梯状结构，而共聚焦无法分辨。OTS-12C的FWHM测量值在114-143 nm间，优于OTS-7C（235-386 nm）。此外，OTS-12C也支持SIM成像，时间延迟模式可实现高时空分辨率动态观察，FWHM为82-142 nm。

**2.6 应激下线粒体的延时SIM成像**

在低激光功率（2 mW）下，U2OS细胞中OTS-12C标记的线粒体在200帧连续成像中显示形态变化：从管状结构变为哑铃状，随后可逆恢复为管状，表明在温和ROS应激下嵴可快速重塑。在高功率（6.4 mW）下，观察到含嵴和缺嵴两种亚群的肿胀，且缺嵴线粒体在延长时间内出现新的嵴形成，表明其具有获得IMM折叠（与ATP产生相关）的动力学可塑性。

**2.7 可视化抗氧化剂对线粒体的保护效果**

维生素C（20 μM）或虾青素（10 μM）预处理后，连续SIM成像显示：未处理细胞在4 min内线粒体宽度显著增加、嵴密度下降；而抗氧化剂处理组在4 min内维持稳定的宽度和嵴密度，即使延长时间，宽度变化也显著小于对照组，嵴密度保留更多。表明OTS-12C可作为双功能探针用于超分辨率成像和线粒体应激响应的纳米尺度评估。

**2.8 通过FLIM评估线粒体损伤水平**

STED-FLIM时序成像显示，在3 min内嵴逐渐消失而管状宽度不变，同时OTS-12C荧光寿命从1.303 ns增至1.392 ns。渗透休克实验排除膜张力的主要影响。CCCP（降低线粒体膜电位MMP）和寡霉素（增加MMP）均导致寿命增加，提示MMP非主导因素。进一步实验表明，大单层囊泡（LUV）中寿命随膜有序度增加而增大（DOPC < DOPC/胆固醇 < 鞘磷脂/胆固醇）。棕榈酸（饱和脂肪酸）预处理延长寿命，亚油酸（多不饱和脂肪酸）缩短寿命。因此，OTS-12C荧光寿命变化反映ROS诱导的IMM不饱和脂质氧化导致的膜有序度增加，可作为线粒体功能状态的敏感读数。

**讨论与结论**

本研究通过分子工程策略开发了一系列含羧基和不同烷基链长度的AIE活性异喹啉衍生物（OTS-4C, OTS-7C, OTS-12C）。与未羧基化的类似物相比，这些探针的光毒性显著降低，其机制源于两种协同作用：羧基本质抑制自旋-轨道耦合，以及通过链长依赖性分子堆积调节聚集诱导系间窜越（AI-ISC）。因此，该分子设计可用于精细调控AIE光敏剂的光毒性，开发出能在温和可控氧化应激条件下进行超分辨率成像的功能探针。OTS-7C和OTS-12C均表现出对IMM的特异性和优异的光稳定性，能够通过STED和SIM可视化嵴动力学。与仅关注分辨率不同，本研究提供了独特的功能能力——OTS-12C可控的温和ROS生成可作为内置刺激，探测可调氧化应激下的线粒体结构响应。利用这一特性，研究人员证明了维生素C和虾青素等抗氧化剂在温和ROS刺激下能部分保留嵴结构，为纳米尺度筛选影响线粒体功能的潜在药物建立了新平台。OTS-12C的延时成像捕捉到超微结构动态事件，包括线粒体分裂、嵴重塑和恢复过程。此外，荧光寿命成像提供了对亚优线粒体状态的敏感定量读数。总之，这些发现确立了OTS-12C作为将超分辨率成像与线粒体应激响应功能探究相结合的工具。这一设计框架——调控而非完全消除ROS生成——可指导开发用于研究线粒体病理生理学及评估疾病模型中治疗候选药物的下一代探针。