《Advanced Science》：Vascularized Liver-on-a-Microsphere Reveals Alanine-Glucose Metabolism-Driven Regulation of Liver Function and Injury
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肝小叶（hepatic lobule）作为肝脏的基本功能单位，通过空间化组织多种细胞类型以协调代谢、解毒及免疫调控。然而，如何在体外高效重构其层级化血管微结构仍为核心挑战。本研究报道了一种血管化微球肝脏芯片（vascularized liver-on-a-mi
肝小叶（hepatic lobule）作为肝脏的基本功能单位，通过空间化组织多种细胞类型以协调代谢、解毒及免疫调控。然而，如何在体外高效重构其层级化血管微结构仍为核心挑战。本研究报道了一种血管化微球肝脏芯片（vascularized liver-on-a-microsphere, VLOM）系统，能够在单个微尺度水凝胶颗粒内重现肝小叶样结构与功能。研究人员采用微流控-气溶胶（microfluidic-aerosol）制造策略，制备了具有粗糙纹理表面及内置空间定位标志的分区化微球，以实现多种肝脏细胞类型的空间定位并支持内皮屏障形成。VLOM表现出均匀的形态学特征、结构稳定性及高细胞活力，伴随增强的肝脏功能，包括白蛋白和尿素合成升高，以及CYP2B6和CYP3A4表达上调。代谢组学分析揭示了丙氨酸-葡萄糖代谢循环（alanine-glucose metabolic cycle）的激活，该循环增强了生物合成与解毒能力。补充丙氨酸或葡萄糖可进一步恢复肝功能并减轻利福平（rifampicin）诱导的肝毒性，凸显了该代谢循环在维持代谢弹性中的保护作用。这一可规模化生产的血管化微球系统融合了微工程精度与生理保真度，为肝脏代谢建模及药物反应评估提供了高通量途径。
本研究旨在开发一种能够模拟肝小叶复杂微环境的体外模型，以解决现有肝脏模型在结构保真度、代谢功能及高通量制造性方面的不足。肝小叶作为肝脏的基本结构与功能单位，其内部肝细胞（hepatocytes）、库普弗细胞（Kupffer cells）、肝星状细胞（hepatic stellate cells）及内皮细胞（endothelial cells）等构成的空间层级结构对协调代谢通量和细胞间通讯至关重要。然而，传统二维（2D）培养缺乏三维（3D）架构和异质性信号，球体（spheroid）和类器官（organoid）系统虽改善了细胞间通讯，但存在再现性低、成熟时间长及扩散限制等问题。现有微加工技术虽能实现多细胞构建体的可控组装，但多数设计依赖随机细胞包载，缺乏空间控制及血管屏障，无法支持定向物质转运和功能分区。因此，构建具有空间有序、血管化微域的肝小叶模型仍是未解决的工程难题。
研究人员开发了血管化微球肝脏芯片（VLOM）系统，该系统在单个海藻酸盐水凝胶颗粒内重建肝小叶样架构和功能。灵感来源于天然单个肝小叶的辐射状组织，研究团队采用定制微流控-气溶胶策略，制备具有可调表面粗糙度的六分区海藻酸微球。微球内部分区实现肝细胞（HepG2）、肝星状细胞（LX-2）和类库普弗THP-1细胞的空间包载，重建实质-非实质细胞相互作用；工程化粗糙表面促进Matrigel吸附和血管内皮细胞（HUVEC）单层自组装，形成半透性屏障，支持类肝窦的定向扩散和信号交换。该研究发表于《Advanced Science》。
关键技术方法包括：微流控-气溶胶制造技术制备六分区微球，利用荧光纳米颗粒和磁性纳米颗粒作为空间定位标志物；微球表面粗糙度调控以促进Matrigel沉积和内皮屏障形成；动态培养系统；活/死细胞染色和Hoechst 33342染色评估细胞活力；VE-cadherin和CD31免疫荧光染色验证内皮屏障；异硫氰酸荧光素（FITC）标记葡聚糖渗透性实验评估屏障功能；定量实时PCR（qRT-PCR）检测药物代谢酶表达；酶联比色法检测白蛋白、尿素、丙氨酸、丙酮酸、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平；液相色谱-三重四极杆串联质谱（LC-QqQ-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析；主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行代谢数据解析。
在微球制备与表征方面，研究人员使用六通道微流控芯片制备六分区微球，海藻酸钠溶液含荧光纳米颗粒作为分散相，在层流效应下形成稳定六分区流，经导电针在高电压电场中脱落，下落过程中与CaCl
2气溶胶接触产生局部非均匀交联，形成表面粗糙纹理，最终在全交联收集槽中稳定化。荧光显微成像显示红绿信号均匀分布于预定分区，交叉污染可忽略；直径变异系数（CV）低于4%，证实单分散微球的成功制备。表面形貌观察显示火山口样粗糙结构。在VLOM构建与评估方面，研究人员将HepG2、LX-2、分化THP-1细胞包载于内部分区，以磁性纳米颗粒作为定位标志，相邻分区分别装载LX-2细胞和分化THP-1细胞，并以红/绿色荧光纳米颗粒标记实现精确定位。粗糙表面微球浸入Matrigel修饰后，HUVEC悬浮培养3天内即贴附形成细胞层，5天时建立致密内皮屏障层。活/死染色显示所有细胞类型在两种条件下5天内均保持高存活率（>98%），延长培养至14和20天活力仍稳定在80%以上。VE-cadherin和CD31免疫荧光证实内皮屏障的黏附功能和完整性。FITC-葡聚糖渗透性实验显示，FITC（0.4 kDa）和3-5 kDa葡聚糖可穿透内皮层，而40 kDa葡聚糖被显著限制，150 kDa扩散极少，表明HUVEC覆盖微球支持选择性分子渗透，允许小分子转运而抑制大分子穿透。
在功能评估方面，研究人员比较了VLOM与单培养微球的肝脏功能。以低剂量利福平（10 μM）诱导CYP3A4和CYP2B6表达，以噻替呱（4 μM）和酮康唑（10 μM）分别作为CYP2B6和CYP3A4抑制剂处理。VLOM在激动剂暴露后CYP2B6和CYP3A4 mRNA表达显著上调，抑制剂处理后明显下调；而LX-2和HepG2微球变化不明显，表明VLOM具有更强的代谢响应性。VLOM的白蛋白合成和尿素产量较单培养微球显著增强，证明整合的VLOM架构提供更强的肝脏相关功能表现。
代谢组学分析揭示了VLOM与单培养微球之间的显著代谢差异。VLOM总代谢物水平分别较LX-2和HepG2微球提高2.67倍和2.14倍，24和21种差异代谢物被鉴定，14种为共同差异物。PCA和OPLS-DA显示显著代谢分离。上调代谢物中，葡萄糖、丙酮酸、乳酸等糖酵解和糖异生中间体升高，琥珀酸和苹果酸等三羧酸（TCA）循环中间体增加；丙氨酸、组氨酸、脯氨酸和甘氨酰-谷氨酰胺升高提示丙氨酸-葡萄糖循环促进；鸟氨酸升高反映尿素循环通量增加；吡哆醛升高支持转氨活性增强。下调代谢物中，5-氧脯氨酸减少提示谷胱甘肽循环加速，赖氨酸和胞苷减少反映蛋白质和核苷酸合成前体消耗，谷氨酰胺下降表明其快速转化为谷氨酸进入TCA循环或氨解毒途径。
针对丙氨酸-葡萄糖代谢循环的深入分析表明，葡萄糖和丙氨酸在VLOM中上调最为显著。与LX-2微球相比，VLOM显著影响丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙酮酸代谢、半乳糖代谢及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成通路；与HepG2微球相比，影响丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、TCA循环、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生及淀粉蔗糖代谢通路。外源性丙氨酸（8 mM）补充实验显示，VLOM基础丙酮酸、葡萄糖和尿素水平分别约为LX-2微球的2.5倍、2.0倍和1.15倍；补充后单培养微球各指标均显著升高，证实VLOM固有更高丙氨酸-葡萄糖循环通量，共培养系统通过增强该循环改善葡萄糖产生和尿素合成。
在肝损伤保护方面，研究人员采用高剂量利福平（200 μM）建立肝损伤模型，白藜芦醇（100 μM）作为阳性对照。高剂量利福平显著降低白蛋白分泌和尿素产量，升高ALT和AST表达；白藜芦醇处理可恢复这些指标。丙氨酸（8 mM）和葡萄糖（10 mM）补充显著改善受损VLOM功能，增加白蛋白和尿素产量，降低ALT和AST水平，其中丙氨酸显示比葡萄糖更高的代谢效率，可能与其在能量稳态和氮转运中的独特作用有关。
研究结论部分指出，VLOM在单颗水凝胶颗粒上重建肝小叶样微环境，整合空间程序化的多种肝脏特异性细胞共培养与类窦内皮屏障。内置磁性和荧光基准实现分区空间寻址，确保微球内确定性细胞定位和分析。VLOM展现出均匀形态、稳定架构和高细胞活力，增强的肝脏功能表现为白蛋白和尿素合成增加、CYP2B6和CYP3A4表达上调。VLOM通过激活丙氨酸-葡萄糖代谢循环增强生物合成和解毒功能，有效缓解利福平诱导的肝损伤并支持优异的肝脏表现。丙氨酸或葡萄糖补充进一步恢复白蛋白和尿素产量，确认该循环在维持肝脏弹性中的保护作用。VLOM系统以可规模化的形式整合结构精度、血管功能和代谢相关性，为研究肝脏代谢、药物毒性和细胞间通讯提供了多功能工具。未来优化将聚焦于整合更具生理相关性的实质细胞来源，如原代人肝细胞或分化HepaRG细胞，并进一步精细化血管结构，通过将内皮细胞引入确定性内部分区或排列多层内皮-实质细胞构型，创建更仿生化的内皮-实质界面。
