多阳离子肽工程改造噬菌体内溶素以扩大宿主范围并增强对芽孢杆菌属的抗菌和抗生物膜活性

《Biotechnology and Bioengineering》：Polycationic Peptide Engineering of Phage Endolysins Expands Host Range and Enhances Antibacterial and Antibiofilm Activities Against Bacillus Species

　　

抗菌耐药性的指数级增长凸显了开发替代抗菌策略的迫切需求，包括噬菌体来源和工程化蛋白制剂，如内溶素和人工裂解酶。在本研究中，研究人员报告了基于P19_358裂解素（一种糖苷水解酶家族24酶）的新型人工裂解酶的理性设计、表达和功能表征。天然P19_358裂解素表现出有限的抗菌活性，主要针对枯草芽孢杆菌，并且需要乙二胺四乙酸（EDTA）预处理才能作用于革兰氏阴性菌。为克服这一限制，研究人员使用多阳离子肽（包括天蚕素A衍生肽片段和多阳离子九肽（PCNP），并带有或不带柔性甘氨酸-丝氨酸连接子）构建了C端融合蛋白。结构和生物物理分析证实，肽融合未干扰天然催化结构域。功能测定表明，与天然酶相比，工程化人工裂解酶表现出增强的抗菌活性和扩大的宿主范围。在这些构建体中，天蚕素A融合的人工裂解酶（Art1和Art2）显示出最高的杀菌活性，在枯草芽孢杆菌MTCC 121^T中实现约5.4 log₁₀的减少，在短小芽孢杆菌MTCC 1640^T和地衣芽孢杆菌MTCC 429^T中实现约4.9 log₁₀的减少。此外，Art2表现出显著的抗生物膜活性，在测试的芽孢杆菌属中显著减少了生物膜形成。稳定性研究表明，与天然裂解素相比，Art2具有更优的温度、酸碱度和盐度耐受性，在广泛的环境条件下保持活性。这些发现表明，理性人工裂解酶工程可以在保留酶功能的同时显著增强抗菌效力、谱系和稳定性。值得注意的是，Art2作为进一步开发为强效抗菌剂的有前景候选物，在食品安全和临床环境中具有潜在应用。

**论文解读：多阳离子肽工程改造噬菌体内溶素以扩大宿主范围并增强对芽孢杆菌属的抗菌和抗生物膜活性**

**研究背景与问题**
抗菌耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁，2019年导致127万人直接死亡和500万相关死亡，预计到2050年每年死亡人数将达1000万。抗生素的广泛使用加剧了多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）和泛耐药菌株的出现，而新型抗生素的发现因成本高、周期长而进展缓慢。噬菌体来源的蛋白制剂，如内溶素（endolysins），因其明确的剂量、低细胞毒性、快速杀菌作用和低耐药性发展概率而受到关注。然而，天然内溶素对革兰氏阳性菌效果良好，但对革兰氏阴性菌因外膜屏障而效力有限。为克服这一限制，研究人员开发了人工裂解酶（artilysins），即内溶素与膜破坏肽的融合蛋白。本研究以Aeromonas dhakensis噬菌体P19编码的P19_358裂解素为基础，该酶属于糖苷水解酶家族24，天然仅对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis MTCC 121^T）有裂解活性，且需乙二胺四乙酸（EDTA）预处理才能作用于革兰氏阴性菌，宿主范围狭窄。因此，本研究旨在通过C端融合多阳离子肽，扩大其抗菌谱并增强效力，为食品安全和临床感染管理提供新型抗菌剂。

**研究方法**
研究人员采用以下关键技术方法：
1. **蛋白质工程与结构预测**：利用AlphaFold V3服务器预测P19_358裂解素及工程化人工裂解酶（artilysins）的三维结构，并通过TM-align进行结构比对，评估C端融合肽对核心催化结构域的影响。
2. **基因克隆与蛋白表达纯化**：将人工裂解酶基因克隆至pET-28a(+)载体，转化至Escherichia coli BL21(DE3)并诱导表达，通过Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白，经SDS-PAGE和分光光度法鉴定。
3. **功能表征**：通过浊度降低测定和菌落形成单位（CFU）计数评估抗菌活性；通过结晶紫染色法评估抗生物膜活性；通过差示扫描荧光法（DSF）和圆二色（CD）光谱分析热稳定性与二级结构。
4. **形态学观察**：利用扫描电子显微镜（SEM）观察细菌细胞形态变化。
样本来源：Bacillus subtilis MTCC 121^T、Bacillus pumilus MTCC 1640^T和Bacillus licheniformis MTCC 429^T购自印度微生物典型培养物保藏中心（MTCC）。

**研究结果**
**3.1 人工裂解酶的概念设计、三维结构与结构叠加**
研究人员将天蚕素A（Cecropin A）衍生肽（KWKLFKKI）和多阳离子九肽（PCNP，KRKKRKKRK）通过柔性连接子（GSA、GSGS、GS）或无连接子融合至P19_358裂解素的C端，构建了6种人工裂解酶（Art1-Art6）。结构比对显示，所有人工裂解酶与天然酶的核心均方根偏差（RMSD）为0.21-0.66 ?，TM-score为0.82-0.94，MaxSub score为0.75-0.93，表明C端融合未干扰催化结构域。

**3.2 表达与纯化**
所有人工裂解酶基因成功克隆并表达，经Ni-NTA纯化后，SDS-PAGE显示蛋白在预期分子量处，且主要存在于可溶部分。

**3.3 最佳剂量确定**
通过浊度降低测定，确定P19_358裂解素对枯草芽孢杆菌的最佳工作浓度为5.32 μM，该浓度在后续实验中使用。

**3.4 宿主谱测定**
斑点试验显示，天然P19_358裂解素仅裂解枯草芽孢杆菌，而所有人工裂解酶在无EDTA预处理下均能裂解枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，表明宿主范围扩大。

**3.5 抗菌活性测定**
浊度降低测定显示，Art1和Art2在20分钟内对枯草芽孢杆菌达到64-66%的相对活性，2小时后达75-86%；而天然酶仅16%和69%。对短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，Art2活性最高。CFU计数表明，Art2对枯草芽孢杆菌减少5.4 log₁₀，天然酶仅3.9 log₁₀；对短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，天然酶无活性，而人工裂解酶减少4.4-4.9 log₁₀。对EDTA预处理的革兰氏阴性菌，Art2与天然酶活性无显著差异。

**3.6 抗生物膜活性评估**
Art2处理显著抑制生物膜形成：枯草芽孢杆菌生物膜残留20-28%，短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别为30-40%和43-48%；而天然酶处理残留70%以上，对后两种菌无显著抑制。但对成熟生物膜，两者均无显著效果。

**3.7 稳定性研究**
温度稳定性：Art2在4-45°C保持活性，55°C时残留27%活性，优于天然酶。pH稳定性：两者在pH 5活性最高，Art2在pH 4-7保持90-100%活性，而天然酶仅pH 5-7。盐度稳定性：Art2在0.1-0.4 M NaCl保持80%以上活性，0.5 M NaCl时48%，而天然酶在0.4 M NaCl仅53%，0.5 M NaCl时8%。

**3.8 pH依赖性热稳定性谱**
DSF分析显示，所有蛋白在pH 6时热稳定性最高（Tm值最大），但天然酶的Tm值略高于人工裂解酶。

**3.9 二级结构分析**
CD光谱显示P19_358裂解素和Art2均以α-螺旋为主，结构相似，表明C端融合未改变整体构象。

**3.10 三级结构表征**
荧光光谱显示两者最大发射波长均为339 nm，表明芳香族残基微环境类似，三级结构未受显著影响。

**3.11 SEM形态学观察**
SEM显示，Art2处理导致枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌细胞完全裂解，出现大量碎片；而天然酶仅裂解枯草芽孢杆菌，对短小芽孢杆菌仅轻微改变表面形态。

**讨论与结论**
讨论部分指出，C端多阳离子肽融合未干扰催化结构域，并显著增强了抗菌谱、稳定性和抗生物膜活性。Art2因含天蚕素A和柔性连接子GSGS而表现最佳，其热稳定性（4-45°C）、pH耐受性（pH 4-7）和盐度耐受性（0-0.4 M NaCl）均优于天然酶，且能有效抑制芽孢杆菌生物膜形成。研究结论强调，理性人工裂解酶工程通过肽融合成功克服了天然内溶素的宿主范围限制，Art2作为强效抗菌剂在食品安全（如乳制品和肉类去污染）、水产养殖病原菌管理及多重耐药芽孢杆菌感染治疗中具有潜力。未来需进行体内效价、规模化生产和监管路径评估以加速转化。该研究发表在《Biotechnology and Bioengineering》。
**研究结论翻译**：本研究成功实现了Aeromonas dhakensis噬菌体来源的P19_358裂解素的克隆、表达和理性工程化，将其转化为高效人工裂解酶。天然酶仅对枯草芽孢杆菌MTCC 121^T有窄谱裂解活性，而C端与阳离子肽融合显著扩大了抗菌谱，包括短小芽孢杆菌MTCC 1640^T和地衣芽孢杆菌MTCC 429^T，在低浓度（5.3 μM）下实现>3 log CFU的减少。工程化人工裂解酶还表现出稳健的热稳定性（高达50°C保持30分钟）和优越的抗生物膜效价，在24小时测定中破坏芽孢杆菌生物膜70-85%。这些发现验证了肽融合作为克服天然内溶素宿主范围限制的有效策略，并产生了具有增强裂解谱的裂解素。该人工裂解酶的稳定性、效力和生物膜破坏能力使其成为非抗生素生物控制的有前景候选物，可用于食品加工（乳制品和肉类去污染）、水产养殖病原菌管理以及针对多重耐药芽孢杆菌感染的治疗应用。未来优化应聚焦于体内效价、可扩展性和监管路径评估，以加速临床和工业转化。