血小板反应蛋白-4（Thrombospondin-4，THBS4）通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-Kinase/Protein Kinase B，PI3K/AKT）通路调控脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的髓核细胞核凋亡及炎症

《Immunity, Inflammation and Disease》：Thrombospondin-4 Regulates Lipopolysaccharide-Induced Apoptosis and Inflammation in Nucleus Pulposus Cells via the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Protein Kinase B Pathway

　　

目的　本研究探讨血小板反应蛋白-4（Thrombospondin-4，THBS4）在椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration，IDD）中的表达谱，并明确其是否通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-Kinase/Protein Kinase B，PI3K/AKT）通路调控脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的髓核细胞（Nucleus Pulposus Cells，NPCs）凋亡与炎症。方法　整合GeneCards及基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO；数据集GSE186542）筛选IDD相关差异表达基因，并行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析以探索潜在信号机制。采用LPS刺激NPCs建立体外炎症损伤模型。通过逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blotting）、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）染色、流式细胞术及酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）评估THBS4过表达对细胞增殖、凋亡、炎性细胞因子分泌及细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）蛋白表达的影响。使用PI3K抑制剂LY294002验证PI3K/AKT通路介导THBS4相关效应。结果　生物信息学分析显示THBS4在IDD中显著下调且与PI3K/AKT通路密切相关。功能实验表明THBS4过表达可明显促进NPCs增殖、抑制凋亡、减少肿瘤坏死因子α（Tumour Necrosis Factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1beta，IL-1β）及IL-6分泌、增加IL-10、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）及Ⅱ型胶原（Collagen type II）表达。上述保护作用伴随PI3K/AKT通路激活，且可被LY294002显著逆转。结论　THBS4通过激活PI3K/AKT通路减轻LPS诱导的NPCs损伤，发挥抗凋亡及抗炎效应；THBS4激活PI3K/AKT的具体上游分子机制需进一步探究。结果表明THBS4可作为IDD治疗的潜在分子靶点。

本文发表于《Immunity, Inflammation and Disease》，研究围绕椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration，IDD）这一引起慢性下腰痛的主要病因展开。目前IDD缺乏可有效逆转病程的临床干预手段，其原因包括早期无症状及分子发病机制尚未完全阐明。髓核细胞（Nucleus Pulposus Cells，NPCs）凋亡、细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）降解及异常促炎因子表达是IDD的核心病理特征，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的NPC炎症损伤模型是IDD体外研究的经典工具。血小板反应蛋白-4（Thrombospondin-4，THBS4）属血小板反应蛋白家族钙结合ECM蛋白，既往报道其在心肌重塑、肿瘤等过程中可通过整合素β1（Integrin β1，ITGB1）激活PI3K/AKT通路，但在IDD中的表达及作用不明。研究人员据此假设THBS4通过PI3K/AKT通路调控LPS诱导的NPC损伤，并通过生物信息学分析联合体外细胞实验及通路抑制救援实验进行验证，最终证实THBS4在LPS处理的NPCs中显著下调，其过表达通过激活PI3K/AKT通路发挥抗凋亡、抗炎及ECM表型维持的保护作用，该保护效应可被PI3K特异性抑制剂LY294002逆转，提示THBS4是IDD潜在的分子治疗靶标。

研究人员采用的主要关键技术方法如下：从GeneCards数据库检索"intervertebral disc degeneration"相关基因，并从GEO数据库（GSE186542）获取IDD差异表达基因取交集，经KOBAS行KEGG通路富集分析；分离培养人源髓核细胞（NPCs，ScienCell公司来源），以10 ng/mL LPS处理24 h建立体外炎症损伤模型，部分组转染THBS4过表达质粒（OE-THBS4）或空载对照（OE-NC），并使用PI3K抑制剂LY294002（20 μM）预处理行救援实验；采用RT-qPCR检测基因mRNA水平，Western Blot检测THBS4、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、Aggrecan及Collagen type II蛋白表达，EdU染色检测细胞增殖率，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率，ELISA检测上清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度；数据以均值±标准差表示，两组间t检验、多组间单因素方差分析（One-way ANOVA）加Tukey事后检验进行统计学分析（p＜0.05为差异有统计学意义）。

研究结果如下：

3.1 THBS4 Is Downregulated in LPS-Induced NPCs

研究人员整合GEO数据集GSE186542与GeneCards中IDD相关基因获72个交集差异表达基因，THBS4显著低表达；经LPS（10 ng/mL，24 h）处理人NPCs后，RT-qPCR及Western Blot均证实THBS4 mRNA及蛋白水平较对照组显著下降（p＜0.0001），说明THBS4在LPS诱导的NPC炎症损伤模型中明显下调，提示其参与IDD炎症相关病理过程。

3.2 THBS4 Regulates LPS-Induced Proliferation and Apoptosis in NPCs

研究人员将OE-THBS4转染入LPS刺激的NPCs，验证过表达成功后行功能检测。EdU实验显示LPS抑制NPC增殖，THBS4过表达显著恢复EdU阳性细胞比例；流式细胞术显示LPS升高凋亡率，THBS4过表达显著降低凋亡率；Western Blot示LPS上调Bax、下调Bcl-2，THBS4过表达逆转该趋势（Bax↓、Bcl-2↑）；同时LPS下调ECM标志分子Aggrecan与Collagen type II，THBS4过表达使其回升。结论：THBS4过表达减轻LPS所致NPC增殖抑制与凋亡并促进ECM合成恢复，具保护性作用。

3.3 THBS4 Modulates the Expression of Inflammatory Cytokines in LPS-Stimulated NPCs

研究人员收集各组培养上清行ELISA检测。LPS显著升高TNF-α、IL-1β、IL-6分泌并降低IL-10；THBS4过表达组中TNF-α、IL-1β、IL-6较LPS组显著下降，IL-10显著上升。结论：THBS4在LPS诱导的NPCs中发挥明显抗炎效应，抑制促炎因子、促进抗炎因子释放。

3.4 THBS4 Alleviates LPS-Induced Damage in NPCs via Activation of the PI3K/AKT Pathway

研究人员对72个IDD相关差异基因行KEGG富集，PI3K-AKT信号通路显著富集且THBS4映射于该通路。Western Blot检测通路关键分子：LPS组p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT比值较对照组显著降低；THBS4过表达组p-PI3K与p-AKT蛋白水平及磷酸化比值较LPS组显著升高。结论：THBS4可激活PI3K/AKT通路，其保护作用与PI3K/AKT磷酸化水平上调相关。

3.5 THBS4 Mediates LPS-Induced Proliferation, Apoptosis, and Inflammation in NPCs via the PI3K/AKT Pathway: Validation by LY294002 Rescue Experiments

研究人员设LPS＋OE-THBS4组与LPS＋OE-THBS4＋LY294002组验证通路必要性。Western Blot确认LY294002有效抑制THBS4过表达引起的PI3K与AKT磷酸化升高。功能上：THBS4过表达促增殖效应被LY294002削弱；THBS4过表达抑凋亡效应被LY294002逆转（凋亡率回升，Bax↑、Bcl-2↓）；THBS4过表达上调Aggrecan与Collagen type II被LY294002抑制；THBS4过表达降TNF-α、IL-1β、IL-6及升IL-10的抗炎效应同样被LY294002取消。结论：THBS4对NPCs的多重保护——抗凋亡、抗炎及ECM表型维持——依赖于PI3K/AKT信号通路的激活。

讨论与结论总结：

研究人员在讨论中指出，IDD是以NPC功能障碍、炎症微环境、ECM失衡为特征的复杂疾病，THBS4作为钙结合ECM糖蛋白以往在心脏、神经组织修复中有报道，而在IDD中作用首次被探明。本研究通过生物信息学筛选结合体外实验首次系统证明THBS4在LPS诱导的人NPCs中低表达，过表达THBS4可促进NPC增殖、抑制凋亡、维持Aggrecan与Collagen type II表达、下调促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）并上调抗炎因子IL-10，上述效应通过激活PI3K/AKT通路实现且可被LY294002阻断，推测THBS4可能经由整合素-FAK轴激活PI3K/AKT，此上游机制有待后续验证。研究局限包括LPS急性炎症模型未能完全模拟IDD慢性退变全过程、未检测FAK及下游GSK3β/mTOR等分子、未设LPS＋OE-NC对照组、缺乏临床IDD组织及体内动物模型验证。作者认为THBS4是IDD潜在的关键抗炎抗凋亡调节分子及治疗靶点。

原文结论翻译：

THBS4通过激活PI3K/AKT信号通路减轻LPS诱导的髓核细胞损伤，发挥抗凋亡及抗炎作用；THBS4激活PI3K/AKT的具体上游分子机制尚需进一步研究。研究结果表明THBS4可作为椎间盘退变的潜在治疗靶点。