《Immunity, Inflammation and Disease》：LncRNA Mirt2 Attenuates Osteoarthritis Progression by Promoting miR-429/TBK1-Mediated Autophagy
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**摘要**
**目的**：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种在中年及老年人群中普遍存在的慢性退行性关节疾病。尽管已有多种长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）被证实与OA进展相关，但lncRNA
**摘要**
**目的**：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种在中年及老年人群中普遍存在的慢性退行性关节疾病。尽管已有多种长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）被证实与OA进展相关，但lncRNA Mirt2的作用及其调控机制尚不明确。
**方法**：使用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测正常及OA软骨组织中lncRNA Mirt2、微小RNA-429（miR-429）和TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1, TBK1）的表达水平。使用白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）刺激的软骨细胞作为体外OA细胞模型。实验中使用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）检测、TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）实验、蛋白质印迹（western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法。使用荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）和RNA下拉（RNA pulldown）实验来研究lncRNA Mirt2、miR-429和TBK1之间的相互作用。建立体内OA模型，并使用苏木精-伊红（H/E）染色和番红O/固绿（Safranin O/Fast Green）染色评估软骨损伤情况。
**结果**：在OA软骨组织和IL-1β刺激的软骨细胞中，lncRNA Mirt2的表达显著下调（p < 0.05）。转染lncRNA Mirt2过表达载体导致IL-1β诱导的软骨细胞增殖显著增加，细胞凋亡和炎症反应显著减少，自噬水平显著升高（p < 0.05）。功能研究发现，在IL-1β诱导的软骨细胞中，lncRNA Mirt2通过充当分子海绵（海绵效应）吸附miR-429，从而发挥竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）的作用。此外，miR-429直接靶向TBK1。挽救实验表明，过表达miR-429或抑制TBK1能有效抵消lncRNA Mirt2上调在IL-1β刺激的软骨细胞中的功能效应，逆转其对细胞增殖和自噬的促进作用以及对细胞凋亡的抑制作用。体内实验表明，过表达lncRNA Mirt2能下调miR-429，上调TBK1，显著减轻OA小鼠的软骨损伤，并加速自噬过程（p < 0.05）。
**结论**：LncRNA Mirt2通过激活miR-429/TBK1介导的自噬，促进软骨细胞增殖，并减轻软骨细胞凋亡、炎症和软骨退变。因此，lncRNA Mirt2可能成为OA诊断和治疗的潜在靶点。
**论文解读**
**研究背景与意义**
骨关节炎（OA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨重塑、骨赘形成和滑膜炎症为特征的常见退行性关节疾病，在中老年人群中发病率高。随着人口老龄化加剧，OA患病率逐年上升。目前OA的临床治疗主要包括药物治疗和关节置换手术，这些方法主要缓解临床症状，但无法治愈疾病，且无法降低早期OA发病率。关节置换手术还存在手术相关不良结局和假体寿命有限等问题。因此，深入研究OA的发病机制及其分子调控机制，对于疾病的预防和治疗至关重要。OA的发病涉及多种因素，包括衰老、肥胖、关节损伤和遗传易感性等。研究表明，OA具有强烈的遗传基础，分子标志物的研究有助于理解个体易感性和开发新的治疗靶点。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在多种疾病中发挥调控作用。已有研究报道lncRNA Mirt2在脂多糖刺激的巨噬细胞中表达异常降低，并可作为负向调节因子影响细胞炎症反应，在肾病、结肠炎和脂肪肝等疾病中抑制炎症。然而，lncRNA Mirt2在OA中的作用和效应尚未被探索。此外，不同类型的非编码RNA功能相互关联，其相互作用在调控癌症和炎症性疾病等细胞过程中发挥关键作用。微小RNA（miRNA）是一类小非编码RNA，通过结合靶基因的3'-非翻译区（3'-UTR）来调控mRNA的转录后表达。lncRNA与miRNA的相互作用可以调控与后续细胞功能和疾病发展相关的关键基因。研究表明lncRNA Mirt2可与不同miRNA相互作用并影响多种疾病，但lncRNA Mirt2与miRNA在OA中的相互作用调控网络尚未完全阐明。本研究旨在阐明lncRNA Mirt2在OA进展中的功能作用，并探究其潜在的调控机制，重点关注其与特定下游miRNA及自噬通路的相互作用，为OA的防治提供新的靶点和理论依据。本论文发表在《Immunity, Inflammation and Disease》期刊上。
**关键技术方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：1. **临床样本与细胞模型**：收集了30例OA患者和25例无OA创伤截肢患者的软骨组织。从正常软骨组织中分离培养原代人软骨细胞，并使用白细胞介素-1β（IL-1β）刺激构建体外OA细胞模型。2. **分子表达与相互作用检测**：使用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测基因表达，RNA荧光原位杂交（FISH）进行定位分析。通过细胞转染技术过表达或敲低目标分子（lncRNA Mirt2, miR-429, TBK1）。利用荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉（RNA pulldown）实验验证lncRNA Mirt2与miR-429以及miR-429与TBK1之间的直接靶向关系。3. **细胞功能与信号通路分析**：采用EdU实验检测细胞增殖，TUNEL实验检测细胞凋亡，蛋白质印迹（western blot）分析相关蛋白（如凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3，炎症通路蛋白p-p38、p-p65，软骨基质蛋白aggrecan、collagen II，自噬标志物LC3B、Beclin-1、p62等）的表达水平，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症因子（TNF-α、IL-6、NO）水平，免疫荧光染色观察LC3斑点形成。4. **体内动物模型验证**：使用BALB/c小鼠，通过切断内侧半月板胫骨韧带（DMM手术）建立OA模型。通过关节腔内注射携带lncRNA Mirt2的重组慢病毒（LV-Mirt2）进行干预。采用苏木精-伊红（H/E）和番红O/固绿（S-O）染色进行组织学评估，并使用改良Mankin评分和骨关节炎研究学会国际（OARSI）评分系统评估软骨损伤程度。
**研究结果**
**3.1 LncRNA Mirt2在OA组织和IL-1β诱导的软骨细胞中下调**
qRT-PCR结果显示，与正常软骨组织相比，OA软骨组织中lncRNA Mirt2表达显著降低。RNA FISH染色结果进一步证实了OA组织中lncRNA Mirt2表达减少。在IL-1β刺激的软骨细胞中，lncRNA Mirt2表达呈剂量依赖性下降，其中10 ng/mL IL-1β处理效果最显著，因此后续实验选用此浓度构建体外OA模型。这些结果表明lncRNA Mirt2与OA相关。
**3.2 LncRNA Mirt2促进IL-1β诱导的软骨细胞增殖并抑制其凋亡**
在IL-1β诱导的软骨细胞中转染lncRNA Mirt2过表达载体，可显著上调其表达。EdU实验显示，IL-1β处理降低了增殖细胞比例，而过表达lncRNA Mirt2则显著提高了增殖细胞比例。TUNEL实验表明，IL-1β处理增加了细胞凋亡，而过表达lncRNA Mirt2则减少了细胞凋亡。蛋白质印迹分析显示，IL-1β处理上调了促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；而过表达lncRNA Mirt2则逆转了这些变化。这些发现表明，过表达lncRNA Mirt2可提高IL-1β诱导的软骨细胞的增殖能力并抑制其凋亡。
**3.3 LncRNA Mirt2抑制IL-1β诱导的软骨细胞的炎症反应**
ELISA结果显示，IL-1β处理促进了软骨细胞中TNF-α、IL-6和NO的水平，而过表达lncRNA Mirt2则抑制了这些炎症因子的产生。蛋白质印迹分析显示，IL-1β处理上调了磷酸化p38（p-p38）和磷酸化p65（p-p65）蛋白的表达，而过表达lncRNA Mirt2则下调了它们的表达。此外，IL-1β刺激抑制了软骨基质蛋白aggrecan和collagen II的表达，而过表达lncRNA Mirt2则恢复了它们的表达。这些观察结果表明lncRNA Mirt2抑制了IL-1β诱导的软骨细胞的炎症反应。
**3.4 LncRNA Mirt2促进IL-1β诱导的软骨细胞的自噬**
与正常软骨组织相比，OA软骨组织中自噬标志物LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转换和Beclin-1表达受到抑制，而p62表达上调。免疫荧光染色显示，IL-1β处理减少了LC3斑点的形成，而过表达lncRNA Mirt2则增加了自噬斑点的形成。蛋白质印迹结果一致表明，IL-1β刺激抑制了LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转换和Beclin-1表达，并上调了p62表达；而过表达lncRNA Mirt2则恢复了这些自噬标志物的表达。这些发现表明lncRNA Mirt2促进了IL-1β诱导的软骨细胞的自噬。
**3.5 LncRNA Mirt2作为ceRNA直接吸附miR-429**
qRT-PCR结果显示，与正常组织相比，OA软骨组织中miR-429表达显著增加。相关性分析表明，OA组织中lncRNA Mirt2表达与miR-429表达呈显著负相关。在IL-1β诱导的软骨细胞中，miR-429表达增加，而过表达lncRNA Mirt2则降低了其表达。荧光素酶报告实验表明，当miR-429模拟物与野生型lncRNA Mirt2报告载体共转染时，荧光素酶活性显著降低。RIP和RNA下拉实验证实，内源性lncRNA Mirt2在转染了miR-429模拟物或生物素化miR-429的软骨细胞中显著富集，揭示了lncRNA Mirt2与miR-429之间的直接结合，表明lncRNA Mirt2可通过直接吸附miR-429发挥ceRNA的功能。这些数据提示miR-429是lncRNA Mirt2在IL-1β诱导的软骨细胞中的靶向miRNA。
**3.6 TBK1是miR-429在OA中的靶向mRNA**
通过在线数据库预测，TBK1是miR-429的潜在靶基因之一。qRT-PCR显示，与正常组织相比，OA软骨组织中TBK1的mRNA表达显著降低。相关性分析显示，lncRNA Mirt2表达与TBK1表达呈正相关，而miR-429表达与TBK1表达呈负相关。生物信息学分析预测了miR-429与TBK1 3'-UTR的潜在结合位点。荧光素酶报告实验验证了miR-429直接靶向TBK1。此外，IL-1β刺激的软骨细胞中TBK1蛋白水平显著降低，而过表达miR-429进一步抑制了TBK1表达。这些结果提示TBK1是miR-429在IL-1β诱导的软骨细胞中的下游效应分子，表明miR-429/TBK1可能参与了lncRNA Mirt2介导的软骨细胞自噬调控。
**3.7 LncRNA Mirt2通过miR-429/TBK1轴调控IL-1β诱导的软骨细胞的增殖、凋亡和自噬**
为验证lncRNA Mirt2是否通过miR-429/TBK1轴调控OA，研究人员进行了挽救实验。过表达lncRNA Mirt2抑制了IL-1β诱导的软骨细胞中miR-429的表达，而共转染miR-429模拟物则逆转了这一抑制。过表达lncRNA Mirt2诱导了TBK1蛋白表达，而敲低TBK1则抑制了其表达。过表达lncRNA Mirt2促进的细胞增殖可被miR-429过表达或TBK1抑制所抵消。过表达lncRNA Mirt2抑制的细胞凋亡可被miR-429过表达或TBK1抑制所恢复。过表达lncRNA Mirt2促进的自噬（表现为LC3斑点增加以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ转换和Beclin-1表达上调、p62表达下调）可被miR-429过表达或TBK1抑制所废除。这些结果表明，过表达lncRNA Mirt2促进细胞增殖和自噬、抑制细胞凋亡的作用可被过表达miR-429或敲低TBK1所挽救。
**3.8 过表达LncRNA Mirt2减轻体内OA模型的软骨损伤**
在OA小鼠模型中，关节腔内注射LV-Mirt2可显著上调软骨组织中lncRNA Mirt2的表达。过表达lncRNA Mirt2抑制了miR-429表达并促进了TBK1蛋白表达。组织学分析（H/E和S-O染色）显示，OA组小鼠关节软骨表面不规则、厚度减少、软骨细胞分布紊乱、蛋白聚糖染色减少，Mankin评分和OARSI评分显著升高。过表达lncRNA Mirt2减轻了关节软骨损伤，降低了Mankin评分和OARSI评分。此外，OA小鼠血清中TNF-α、IL-6和NO水平显著升高，而过表达lncRNA Mirt2则降低了这些炎症因子水平。同时，过表达lncRNA Mirt2促进了OA小鼠软骨组织中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ转换和Beclin-1表达，并降低了p62表达。这些结果提示，lncRNA Mirt2可通过miR-429/TBK1轴减轻体内OA模型中的软骨损伤。
**讨论与结论总结**
**讨论部分总结**：OA的特征是软骨基质大量丢失、关节软骨细胞异常凋亡和慢性炎症。其发病机制尚未完全阐明，阻碍了有效防治策略的开发。先前研究表明lncRNAs在OA发病机制中发挥重要作用。本研究与之前报道一致，发现lncRNA Mirt2在OA软骨组织和IL-1β诱导的软骨细胞模型中表达下调，提示其可能参与调控OA进展。本研究发现lncRNA Mirt2可增加软骨细胞增殖，并通过调节凋亡相关蛋白抑制细胞凋亡。研究还证实了lncRNA Mirt2的抗炎能力，其过表达能抑制炎症因子（TNF-α、IL-6、NO）的产生，抑制p38 MAPK和NFκB信号通路的激活，并恢复软骨基质蛋白aggrecan和collagen II的表达。自噬在OA微环境中受到抑制，本研究证实OA组织中自噬标志物（LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin-1）下调而p62上调。LncRNA Mirt2作为miR-429的上游调节因子，挽救了IL-1β诱导的自噬抑制。TBK1被证实是miR-429的直接靶点，在OA组织中下调。挽救实验表明，lncRNA Mirt2通过抑制miR-429上调TBK1表达，而抑制TBK1或过表达miR-429可减弱lncRNA Mirt2的保护作用。体内实验进一步证实了lncRNA Mirt2通过miR-429/TBK1轴保护OA软骨损伤。尽管本研究结果具有前景，但仍存在局限性，例如需要在更临床相关的大型动物模型中验证，并需开发安全高效的递送系统或小分子激动剂来增强内源性lncRNA Mirt2表达。
**研究结论翻译**：本研究证实，上调的lncRNA Mirt2通过调控miR-429/TBK1轴，调节OA中的多种生物学过程，包括促进细胞增殖和自噬，以及抑制细胞凋亡和炎症。这些结果为理解OA的发病机制提供了新的见解，并表明lncRNA Mirt2可能成为OA治疗的一个有前景的靶点。
