PRC1纳米球在果蝇胚胎发育过程中组织Hox染色质

《Cell Discovery》：PRC1 nanoglobules organize Hox chromatin during Drosophila embryogenesis

研究人员发现Polycomb组蛋白（PcG）在发育过程中对于维持关键发育基因的沉默是必需的。在果蝇中，PcG蛋白结合到离散的基因组元件，即Polycomb响应元件（PREs）。PcG蛋白形成两类复合物：Polycomb抑制复合物2（PRC2）催化H3K27me3沉积，这是一种覆盖大染色质域的组蛋白修饰；经典的PRC1复合物既可结合PREs，也可结合H3K27me3标记。在细胞核内，通过共聚焦显微镜分析时，PcG亚基及其相关染色质定位于Polycomb foci。然而，该方法的空间分辨率不足，阻碍了Polycomb机制相对于其目标染色质的精确定位。为解决这一长期存在的问题，研究人员采用超分辨受激发射损耗（STED）显微镜分析了果蝇胚胎。研究人员观察到，与Hox基因簇相关的Polycomb foci由多个动态的PRC1亚结构组成，并将其命名为“PRC1纳米球”。与周围的H3K27me3染色质相比，PREs与这些纳米球的关联更密切。通过对整个双胸复合体（BX-C）位点进行成像，研究人员鉴定了与PRC1纳米球部分重叠的染色质亚结构，表明它们形成不同的组装体。此外，聚合物模拟表明，PREs与PRC1纳米球之间的相互作用可以驱动BX-C结构域的压缩和定位。综上所述，这些数据提示，PRC1纳米球通过建立目标位点的三维架构，成为维持Polycomb依赖性沉默的关键分子组装体。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
Polycomb组蛋白（PcG）是维持发育基因调控沉默的关键因子，其作用机制涉及两类抑制复合物：PRC2催化H3K27三甲基化（H3K27me3），而经典PRC1则可结合PREs及H3K27me3标记。在细胞核内，PcG蛋白及相关染色质常聚集成Polycomb foci，但传统共聚焦显微镜的分辨率（约300 nm）无法精确解析这些结构与其目标染色质（如Hox基因簇）之间的空间关系。此外，已有体外研究表明部分PRC1亚基可形成类液滴状凝聚体，但缺乏高分辨率活体成像证据。为解决这一长期难题，研究人员利用超分辨STED显微技术，在果蝇胚胎中解析了PRC1亚基的纳米级组织及其与Hox染色质的相互作用。该研究成果发表在《Cell Discovery》。

**关键技术方法**
研究人员采用超分辨STED显微镜（分辨率约70 nm）对固定果蝇胚胎进行免疫荧光成像，并利用AiryScan显微镜进行活体胚胎实时成像。通过免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）结合STED成像，定位PREs及中间区域相对PRC1纳米球的位置。此外，基于已发表的ChIP-seq数据，利用聚合物模拟（PERM算法）构建BX-C位点的三维染色质模型，并拟合实验数据以揭示PRC1纳米球介导的压缩机制。样本来源为果蝇胚胎（Oregon-R品系及Ph、Pc突变体）。

**研究结果**

**1. 强Polycomb foci由多个PRC1纳米球组成**
通过STED成像，研究人员发现原本在共聚焦显微镜下呈现为均一斑点的强Polycomb foci实际上由多个直径约70 nm的亚结构构成，这些亚结构被命名为“PRC1纳米球”。活体AiryScan成像显示这些纳米球快速移动并不断重塑，排除固定或染色假象。Ph亚基缺失导致Psc、Sce和Pc亚基的核内聚集显著减少，证明Ph是PRC1 foci形成的必要条件。

**2. PRC1纳米球与PREs的关联频率高于中间区域**
研究人员设计了6个PRE探针和4个中间区域探针（针对BX-C和ANT-C位点），通过immuno-FISH结合STED成像定量测量FISH信号中心与Ph/Pc亚结构边界的距离。结果显示，位于Hox簇中央的PREs（如bxd、Fab7）与Ph/Pc纳米球的关联显著高于中间区域（如int2、int3）。位于H3K27me3域边界的PREs（如bx、dAntp）呈中间分布。此外，远离Hox簇的对照染色质（void染色质）关联更弱，而转录激活时PREs和中间区域的关联性显著下降。

**3. Pc亚基缺失影响PREs和中间区域与PRC1纳米球的关联**
在Pc null突变体中，STED成像显示Ph纳米球的数量减少、最小间距增大，但整体foci大小不变。Immuno-FISH发现，除bxd和bx（Ph ChIP信号强）外，多数PREs与Ph纳米球的关联减弱；中间区域int1和int4也受影响。总体而言，Pc缺失导致Ph亚结构的面积和强度下降，表明Pc有利于PRC1与染色质的关联。

**4. Hox染色质优先定位于PRC1纳米球的外周**
对不同胚胎发育阶段（期5-13）的分析揭示，早期（期5-8）PRC1纳米球更大、更多且更动态，后期（期11-13）逐渐致密化。Immuno-FISH距离分布表明，从期9开始，PREs和中间区域常富集于Ph/Pc亚结构边界±50 nm处，即染色质主要位于纳米球的外周而非内部。

**5. BX-C染色质形成独立于PRC1纳米球的亚结构**
采用覆盖整个BX-C位点的寡核苷酸探针进行FISH结合STED成像，发现BX-C染色质形成多个约70 nm的“染色质纳米球”，与Ph纳米球部分重叠但不相同。BX-C纳米球可在无Ph纳米球区域出现，而Ph纳米球常连接这些染色质亚结构，提示两者形成不同的组装体。

**6. PRC1纳米球可解释Ph依赖性BX-C压缩**
聚合物模拟基于Ph突变体中的3D距离数据，通过优化参数（排除体积Jev、PRE-纳米球相互作用Jp、H3K27me3-纳米球相互作用Jh）发现：仅PRE-纳米球相互作用（Jp=6.3 kBT）足以重现Ph介导的BX-C压缩，而H3K27me3相互作用单独无法拟合。进一步模拟成像显示，纳米球密度、Ph标记强度及纳米球大小是控制压缩的关键参数。模拟还表明，PREs的基因组位置比其结合强度更重要。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，PRC1纳米球是动态结构，其与染色质的关联呈概率性（~60%细胞核中PREs接触纳米球），这与快速运动一致。Hox染色质位于纳米球外周而非内部，可能由于PRC1复合物和核小体体积仅占纳米球的一小部分。纳米球不融合为单一凝聚体，可能与快速运动或表面活性物质作用有关。聚合物模拟强调PREs是驱动三维架构的主要元件，而H3K27me3区域起次要作用。

研究结论翻译如下：综上所述，这些数据表明，通过建立靶位点的三维架构，PRC1纳米球是维持Polycomb依赖性沉默的关键分子组装体。