通过优化Passerini反应合成的新型4-(嘧啶-5-基)苯甲醛基α-酰氧基酰胺：体外环氧合酶抑制及计算验证

《Letters in Drug Design & Discovery》：Novel 4-(pyrimidin-5-yl)benzaldehyde based α-acyloxy amides via optimized Passerini reaction: In vitro COX inhibition and computational validation

　　

环氧合酶（COX）在介导疼痛和炎症的前列腺素生物合成中发挥关键作用。COX-2的过度表达与包括慢性炎症和癌症在内的多种病理状况相关。然而，常规非甾体抗炎药（NSAIDs）往往表现出较差的选择性并引起胃肠道副作用，因此需要设计更安全、更具选择性的COX-2抑制剂。研究人员合成了一系列α-酰氧基酰胺（4a-4j），通过将4-(嘧啶-5-基)苯甲醛、取代苯甲酸和叔丁基异腈在优化条件下反应得到。合成化合物经红外光谱（IR）、核磁共振波谱（NMR）和质谱进行表征。采用酶免疫测定试剂盒进行体外COX-1和COX-2抑制实验，并使用Schr?dinger Glide XP模块进行分子对接研究以验证结合亲和力和相互作用模式。所有合成化合物均以良好产率分离得到（58%–78%）。COX-1抑制活性（IC₅₀ = 11.30–41.05 μM）和COX-2抑制活性（IC₅₀ = 2.01–10.01 μM）显示出显著的选择性差异。化合物4d（吡嗪基）、4b（4-Cl-Ph）和4j（4-I-Ph）表现出最强的COX-2抑制效力，IC₅₀值分别为3.11、2.22和2.01 μM，选择性指数（SI）分别为11.30、5.75和7.01，与塞来昔布（SI = 18.15）接近。相比之下，活性最强的COX-1抑制剂为4e（3-NO₂-Ph）、4b和4j，IC₅₀值分别为11.30、12.78和14.11 μM。分子对接结果证实了这些发现，显示在COX-1中与Arg120、Tyr355和Ile517残基形成保守的氢键相互作用，在COX-2中与Arg499、Phe504和Ser516形成氢键，同时在活性通道内存在疏水相互作用和π–π堆积。总体而言，综合生物活性、分子对接和平衡的计算机ADMET评估，确定化合物4b、4d和4j为开发选择性COX-2抑制剂的最有前景的先导候选化合物。

前列腺素是炎症、疼痛和发热的重要介导物质，环氧合酶（COX），尤其是COX-2，在其生物合成过程中发挥关键作用。COX-2的过度表达与癌症、慢性炎症性疾病和心血管异常等多种疾病密切相关。因此，选择性COX-2抑制剂已成为重要的药用工具。为减少非选择性非甾体抗炎药（NSAIDs）的副作用，研究人员致力于开发具有增强COX-2选择性和效力的新型小分子化合物。多组分反应（MCRs）的出现革新了合成化学，能够实现一步法合成结构多样的分子。其中，基于异腈的多组分反应（IMCRs）对于高效且多样化地生成复杂骨架具有重要价值，可缩短反应步骤、简化纯化过程、提高原子经济性并实现快速文库构建，在药物研发中的重要性日益凸显。Passerini反应是一种经典的基于异腈的多组分反应，通过缩合异腈、羧酸和羰基化合物生成α-酰氧基酰胺，已成功应用于构建复杂化合物和杂环骨架，是当代药物化学和药物开发中的有力工具。嘧啶作为一种含氮杂环骨架，其药理重要性已得到充分认可，是许多具有抗病毒、 anticancer、抗炎和抗菌活性的生物活性化合物的结构 motif。近期研究表明，嘧啶衍生物可通过靶向环氧合酶（COX）来减轻炎症和疼痛，且易于通过多组分反应合成，是新药开发的理想骨架。

尽管已报道多种含嘧啶分子和Passerini衍生的α-酰氧基酰胺具有多种药理活性，但将其联合应用于开发选择性环氧合酶（COX）抑制剂的研究仍 largely 未被探索。大多数先前报道的Passerini产物集中于合成方法学或广泛的生物筛选，而Passerini衍生的嘧啶基α-酰氧基酰胺尚未被系统研究作为选择性COX-2抑制剂。基于此，Varsha Saini等研究人员开展了本项研究，将生物活性优越的嘧啶骨架与合成上多功能的Passerini衍生α-酰氧基酰胺药效团相结合，通过芳香族羧酸组分的变化实现快速结构多样化，并进行系统的结构-活性关系（SAR）研究以探索选择性COX抑制。该研究以优化的Passerini三组分反应高效合成了一系列4-(嘧啶-5-基)苯甲醛基α-酰氧基酰胺（4a-4j），并通过体外COX-1/COX-2抑制实验、分子对接、ADMET预测和水解稳定性研究进行综合评价，以识别有前景的先导分子。研究成果发表于《Letters in Drug Design》。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：优化的Passerini三组分反应（P-3CR）合成目标化合物；红外光谱（IR）、核磁共振波谱（¹H NMR和¹³C NMR）和质谱（MS）进行结构表征；酶免疫测定（EIA）试剂盒进行体外COX-1（绵羊源）和COX-2（人重组）抑制活性测定；Schr?dinger分子建模套件中的Glide程序进行分子对接研究，使用PDB数据库中COX-1（PDB: 3KK6）和COX-2（PDB: 3LN1）与塞来昔布复合的晶体结构；以及pkCSM和SwissADME工具进行计算机ADMET性质预测。

研究结果部分：

化学、光谱分析及反应优化。通过4-(嘧啶-5-基)苯甲醛（1）、取代苯甲酸（2a-2j）和叔丁基异腈（3）在活化4 ?分子筛存在下、氮气保护中进行Passerini三组分反应，合成了2-(叔丁基氨基)-2-氧代-1-(4-(嘧啶-5-基)取代苯基)乙基苯甲酸酯类化合物库（4a-4j）。通过改变溶剂和温度优化反应条件，确定乙醇中室温反应24小时为最优条件，产物经后处理和色谱纯化后以中等至优良产率（58%–78%）分离得到结晶固体。红外光谱显示酯羰基在约1720 cm^-1处有特征吸收，酰胺羰基在~1685 cm^-1处；¹H NMR谱中手性次甲基质子以单峰形式出现在δ ~6.0 ppm，叔丁基基团在δ 1.2–1.3 ppm处有强单峰共振；¹³C NMR谱显示羰基诊断信号在165–170 ppm。电子吸电子基团（-Cl、-NO₂、-Br、-I）通常比给电子基团（-OMe、-OH）获得更高产率，杂芳基衍生物（吡嗪、呋喃丙烯酸）也能很好耐受并以高产率生成。尝试变化异腈片段（如4-(2-异氰基乙基)吗?啉、1-(异氰基甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑、1-((异氰基甲基)磺酰基)-4-甲基苯）未能获得预期多组分产物，可能是由于空间位阻和负电子效应导致异腈碳的亲核性降低。水解稳定性研究表明，化合物在pH 7.4生理条件下最稳定，在pH 1.2酸性条件下较不稳定，提示其体内稳定性良好但口服给药时可能部分降解。

生物评价：COX-1/COX-2抑制及构效关系分析。采用酶免疫测定试剂盒评估化合物（4a-4j）对COX-1和COX-2亚型的体外抑制效力，并计算选择性指数（SI）。结果表明，苯甲酸片段上的取代模式对COX-2抑制有显著影响：化合物4d（吡嗪片段）具有最高的选择性指数（SI = 11.30），尽管其效力中等（COX-2 IC₅₀ = 3.11 μM）；卤代衍生物4j（4-I-Ph，SI = 7.01，COX-2 IC₅₀ = 2.01 μM）和4b（4-Cl-Ph，SI = 5.75，COX-2 IC₅₀ = 2.22 μM）表现出强效COX-2抑制，提示对位卤素取代可改善与COX-2二级口袋的结合。给电子基团如甲氧基（4c）和羟基（4f）降低了整体效力（COX-2 IC₅₀ > 7 μM），而强吸电子硝基（4e）有利于COX-1抑制（SI = 1.88）。二溴代衍生物4h和4i显示平衡抑制，呋喃丙烯酸衍生物4g活性较低但仍保持COX-2偏好性。

化合物（4a-4j）与COX-1的计算机分析。分子对接入COX-1（PDB: 3KK6）显示所有十种类似物均以 moderate 的姿态位于环氧合酶通道中，Glide评分在-10.325至-9.299的狭窄范围内。大多数配体与Ile517形成保守氢键，并与Arg120-Tyr355入口区域通过芳香性和阳离子-π接触相互作用。体外最活性的化合物4e（IC₅₀ = 11.30 ± 5.50 μM）、4b（IC₅₀ = 12.78 ± 3.25 μM）和4j（IC₅₀ = 14.11 ± 1.55 μM）也是对接评分最高的配体，而4g评分最弱且IC₅₀最高（41.05 ± 0.50 μM）。

化合物（4a-4j）与COX-2的计算机分析。对接入COX-2（PDB: 1PXX）产生评分-11.56至-10.07的有利姿态。大多数配体呈现保守的三点氢键模式与Arg499、Phe504和Ser516结合，作为首要锚点。评分最佳的4j（-11.56）保留与Arg499（2.373 ?）、Phe504（2.754 ?）和Ser516（2.128 ?）的三联氢键，并与Arg106形成π接触（5.485 ?），与其领先的COX-2效力一致（IC₅₀ = 2.01 ± 0.14 μM）。卤代R1类似物（4b、4j）始终将保守氢键三联体与Arg106 π接触相结合，为引入卤素有利于COX-2结合的残基水平原理提供了依据。

化合物4a-4j的ADMET分析。计算机ADMET分析显示整体口服吸收有利，主要问题为低水溶性和预测的转运体及安全性标志。预测水溶解度低（logS -5.023至-6.714），但Caco2渗透性中等偏高（log P_app 0.425–1.187），人肠道吸收率高（76.88%–96.63%）。所有化合物均为P-糖蛋白底物和抑制剂，提示潜在的外排相关暴露变异性和转运体介导的药物-药物相互作用。分布方面，表观分布容积低-中等，中枢神经系统渗透性有限。代谢方面，所有化合物均为CYP3A4底物，化合物依赖性CYP抑制倾向各异。毒性方面，所有化合物预测hERG I非抑制、AMES突变性除4e外均为阴性，但所有化合物均预测具有肝毒性，hERG II抑制为阳性。

结论部分翻译：通过Passerini三组分反应高效合成了一系列4-(嘧啶-5-基)苯甲醛基α-酰氧基酰胺（4a-4j）并评估了其COX抑制活性。化合物显示中等COX-1抑制（IC₅₀ = 11.30–41.05 μM）和强效COX-2抑制（IC₅₀ = 2.01–10.01 μM），表明具有良好的选择性特征。其中，化合物4d、4b和4j表现出优越的COX-2效力和高选择性指数，与塞来昔布相当。对接研究揭示了COX-1中Arg120、Tyr355和Ile517残基以及COX-2中Arg499、Phe504和Ser516不同的相互作用模式，支持实验结果。此外，化合物4b、4d和4j表现出最平衡的计算机ADMET特征。总体而言，本研究证明嘧啶和Passerini衍生α-酰氧基酰胺药效团的结合为开发选择性COX-2抑制剂提供了可行策略。因此，化合物4b、4d和4j被视为有前景的初步先导化合物，需在 future studies 中进行实验性细胞毒性评价和更广泛的安全性评估。