经优化处理的3型短QT综合征同源hiPSC衍生心肌细胞模型可展现电生理特征及不同的药物反应

《Life Sciences》：Prime-edited isogenic hiPSC-derived cardiomyocyte model of short QT syndrome type 3 reveals electrophysiological phenotypes and differential drug responses

金敏宇|朴正焕|李明熙|李瑟琪|吴正燮|朴信惠|郑英仁|金允世|申惠媛|金珍|金彩允|郑亨民

摘要

短QT综合征是一种遗传性常染色体显性心脏通道疾病，与阵发性心房和心室颤动、晕厥以及突发性心脏骤停相关。尽管短QT综合征是一种众所周知的致心律失常疾病，但由于其罕见性以及诊断上的困难，目前尚无最佳治疗方案。人们已经使用啮齿类动物模型以及患者来源的诱导多能干细胞模型来评估潜在药物的效果，但不同物种和个体之间的生理及遗传差异可能会限制这些模型的准确性。为了解决这些问题，我们利用Prime Editing 7系统将与短QT综合征3型相关的KCNJ2突变引入正常hiPSC系中，从而构建出同源人类iPSC模型，并将其分化为心肌细胞。多电极阵列分析结果显示该模型具有缩短的场电位持续时间，这一体外指标可反映QT间期，进而验证了该模型与SQT3的相关性。奎尼丁在该同源hiPSC心肌细胞中表现出一致的延长FPD的效果，这与少数SQT1患者的临床观察结果一致，也证明了该模型可作为评估治疗策略的可靠体外替代模型。此外，还对另一种尚未经过临床验证的候选药物氯喹进行了测试，结果发现它也能延长FPD并引发异常的自发心跳，表明存在心律失常风险。总体而言，这些研究结果表明，基于同源hiPSC的平台有望帮助阐明罕见遗传性致心律失常疾病的发病机制，并为寻找有效的治疗药物提供帮助。

引言

短QT综合征是一种罕见但致命的心脏通道疾病，其特征是心电图上QT间期异常缩短（<340毫秒），通常在儿童时期出现，并伴有危及生命的心律失常[1]、[2]。短QT综合征共分为七种亚型（SQT1–7），每种亚型都是由离子通道基因中的致病变异引起的，这些基因主要编码心脏钾通道、钙通道亚基或参与复极化的其他蛋白质[3]、[4]。其中，SQT1的报道病例最多，也有不少研究对其进行了有限的临床药理学评估[2]、[5]。然而，SQT1患者的总数仍然极少，其余亚型的出现频率更低[2]、[3]，这也就阻碍了针对包括短QT综合征3型在内的各类短QT综合征开发基于证据的诊疗方法。

SQT3是由KCNJ2基因的功能获得性突变引起的，该基因编码负责I_K?电流的内向整流钾通道Kir2.1[6]。这类突变会使通道保持开放状态，显著加快终末复极化过程，从而导致QT间期缩短[7]、[8]。尽管SQT3具有极高的心律失常风险，但目前全球范围内仅正式报告了284例病例，这使得对其临床表型和治疗效果进行系统性研究极为困难[9]。

目前人们对短QT综合征中药物反应的了解主要基于对SQT1的研究，SQT1也是由KCNH2突变引起的另一类与钾通道相关的亚型。临床研究表明，奎尼丁能够延长QT间期并降低SQT1患者的心律失常风险，这一结果支持了通过调节心脏复极化来治疗短QT综合征的可行性[5]、[10]。不过，目前还不清楚在KCNH2相关SQT1中观察到的治疗反应是否也能适用于KCNJ2相关的SQT3。

值得注意的是，多项研究表明，短QT综合征中对药物的反应在很大程度上取决于基因型。最近有一篇综合性综述探讨了基因变异如何改变遗传性心律失常综合征中的药物疗效，指出其中涉及多种机制，包括离子通道门控功能的改变、药物结合位点的结构变化、通道转运功能的受损以及细胞内调控因子敏感度的变化[10]。即便在SQT1内部，不同的KCNH2突变也会表现出不同的药理特征。

这些研究结果表明，无法仅根据疾病亚型来判断药物疗效，必须在个体突变层面进行评估。这一原则同样适用于SQT3，因为目前对其药理特性仍知之甚少。因此，需要能够重现特定突变表型的可靠疾病模型，才能准确了解SQT3的电生理和药理特性。

为研究SQT3，已有研究通过AAV介导的基因递送技术构建了携带KCNJ2 E299V突变的小鼠模型[11]。不过，由于啮齿类动物与人类在心脏电生理特性上存在显著差异，这些模型在转化应用方面的价值有限，因为这些差异可能会影响疾病表型和药物反应[12]、[13]。相比之下，患者来源的人类诱导多能干细胞模型保留了人类的遗传和生理特征，因此更适合作为开展机制研究和药物反应评估的强大工具[14]。

目前现有的基于hiPSC的短QT综合征模型大多以SQT1为主，尤其是KCNH2 N588K突变相关模型。这些模型不断发展，从最初能够重现APD缩短和致心律失常表型的患者来源hiPSC心肌细胞模型[15]，发展到在单细胞水平上对抗心律失常药物进行药理筛选[16]、[17]、[18]、[19]，再到利用心肌细胞片和心房心肌细胞构建组织级模型[20]、[21]。重要的是，这些研究不仅成功再现了短QT综合征相关的电生理异常和致心律失常表型，还在细胞层面重现了临床观察到的药物反应模式——包括奎尼丁的有效性以及索他洛尔的无效性[5]、[15]——从而证明了hiPSC心肌细胞模型作为能够反映临床结果的可靠体外模型。不过，由于SQT3极为罕见，基于患者来源的hiPSC模型仍然十分有限[22]。作为一种替代方案，通过基因编辑将致病的KCNJ2突变引入正常hiPSC系中，就可以构建出可控的、基因定义明确的同源SQT3疾病模型，便于在体外进行研究。

Prime editing技术是一种功能多样的基因编辑工具，它能够在不造成双链断裂的情况下实现精确的核苷酸替换，从而避免传统CRISPR/Cas9技术中常见的不必要的插入或删除现象[23]。因此，与传统CRISPR/Cas9编辑相比，Prime editing具有更高的编辑精度[24]，尤其适合用于构建由特定点突变引发的遗传性疾病模型。最近，人们又开发出了PE7系统，通过La介导的保护作用提升pegRNA的稳定性，进一步提高了Prime editing的效率[25]。该系统能够稳定pegRNA的3′端延伸部分，从而提高多种细胞类型中的编辑效率[26]。Prime editing技术的进步不仅有助于纠正致病突变以用于治疗，还能将致病变异精确引入正常细胞中，构建出同源疾病模型。这类方法能够在完全相同的遗传背景下直接研究特定突变的功能效应，为研究疾病机制和针对特定突变的疗法提供了有力工具[27]。

因此，在本研究中，我们旨在利用PE7技术构建一个携带KCNJ2 E299V突变的同源hiPSC心肌细胞SQT3模型，该模型能够重现该疾病的电生理特征，并可用于评估不同药物的反应。我们将临床上已知的KCNJ2 c.896A>T（p.Glu299Val；E299V）突变引入正常hiPSC中，从而构建出同源的SQT3 hiPSC系。随后将这些经过编辑的hiPSC分化为心肌细胞，并通过电生理分析确认SQT3典型的复极化异常，同时评估潜在治疗药物的作用效果。

章节摘录

用于Prime editing的质粒

编码Prime editor蛋白以及显性负性MLH1变体hMLH1dn的质粒是根据先前的方法获得的[23]、[24]。为了能够通过荧光信号筛选出成功转染的hiPSC，我们从pCMV-PE7（Addgene，编号214812）中提取含有小RNA结合外切酶保护因子La的PE7编码序列，然后通过EcoRI酶切将其克隆到pCMV-PEmax-P2A-GFP载体（Addgene，编号180020）中（New England Biolabs，美国马萨诸塞州，产品编号R0101S）。用于转染的质粒

构建携带致病KCNJ2突变的同源hiPSC系

为了高效构建SQT3疾病模型，我们选择了临床上已证实与心电图上QT间期显著缩短的患者相关的KCNJ2 E299V突变[6]、[30]。为了构建一个基因定义明确的SQT3人类模型，我们利用PE7系统将该突变引入野生型hiPSC系中（见图1A）。通过对E299V突变的结构分析，我们确定该突变位于Kir2.1通道的细胞质C末端结构域，而这一区域是参与

讨论

在本研究中，我们成功利用PE7技术构建出了携带KCNJ2 E299V突变的同源SQT3 hiPSC系。引入这一致病突变并未影响这些细胞的多能性、分化能力以及核型稳定性（见图1A–G），这表明基于PE7的精准基因组编辑技术可以有效地应用于hiPSC，用于构建遗传性疾病模型，且不会破坏细胞的完整性。携带KCNJ2 E299V突变的hiPSC心肌细胞表现出与

CRediT作者贡献说明

金敏宇：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，实验研究，定量分析，概念设计。朴正焕：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，实验研究，定量分析，概念设计。李明熙：实验研究，数据整理。李瑟琪：写作——审阅与编辑，验证实验。吴正燮：写作——审阅与编辑，验证实验。朴信惠：实验研究，数据整理。郑英仁：实验研究，

知情同意

不适用。

出版许可

不适用。

伦理审批

关于畸胎瘤形成的研究已获得孔敬大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，批准号为KU23225。

关于写作过程中使用生成式AI及AI辅助技术的声明

在准备本论文的过程中，作者使用了ChatGPT来提升手稿的可读性和语言表达质量。在使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。

资金支持

本研究得到了韩国国家研究基金会基础科学研究计划的支持，该计划由教育部门资助（项目编号RS-2023-00240972）。本文的撰写还得到了孔敬大学研究导向型教授支持计划的资助。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。