通过功能性细胞外囊泡高效特异地筛选靶向μ-阿片受体的高亲和力DNA适配体

《Communications Biology》：Efficient and specific selection of high-affinity DNA aptamers targeting μ-opioid receptor via functional extracellular vesicles

　　

核酸适配体是具有前景的下一代针对未表征生物分子和难治性疾病的实验及治疗药物。然而，高效的适配体筛选仍具挑战性。研究人员开发了一种称为细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）-SELEX的功能性筛选方法，该方法通过配体依赖性G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）内吞作用及随后含GPCR的EV释放，高效筛选靶向GPCR的DNA适配体（GPCR是药物靶点的主要类别）。利用该方法，研究人员获得了Dapt-μR——一种对μ-阿片受体（μ-opioid receptor, MOR）具有高亲和力（K_d ≈ 28 nM）但对其他类型阿片受体无结合的DNA适配体。在未经修饰的形式下，Dapt-μR发挥类似吗啡的、纳洛酮敏感的MOR激动剂作用，抑制培养细胞中cAMP（环磷酸腺苷）的积累，并减少原代纹状体神经元中Ca²⁺（钙离子）的内流。此外，Dapt-μR选择性结合于富含MOR的脊髓背角，并在小鼠鞘内注射后产生镇痛效应。这些发现表明，EV-SELEX是一种针对靶标GPCR筛选DNA适配体的强大方法。

## 论文解读：基于功能性细胞外囊泡高效筛选靶向μ-阿片受体的高亲和力DNA适配体

### 研究背景与问题

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）是一类具有七个跨膜结构域的庞大蛋白超家族，在高等脑功能、镇痛等广泛生理过程中发挥核心作用，将胞外配体信号转化为胞内信号。美国食品药品监督管理局批准的药物中有34%靶向GPCR，然而GPCR药物开发仍面临诸多挑战：首先，许多GPCR亚家族成员间配体结合口袋结构相似，限制药物物理可及性；其次，纯化的GPCR脱离细胞膜后丧失天然构象，缺乏合适的候选药物模板。核酸适配体（短单链DNA或RNA）有望突破这一瓶颈，因其可通过形成与靶分子空间互补的三维结构识别多种构象的靶标。现有基于指数富集的配体系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX）方法（如Cell-SELEX）在筛选细胞表面天然构象靶标方面取得进展，但由于PCR偏好性和非特异性适配体去除不彻底，所得适配体常存在靶标亲和力或特异性低的问题。为此，研究人员开发了名为细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）-SELEX的新方法，利用配体结合依赖的GPCR内吞及含靶标GPCR的EV释放这一生理细胞反应作为主要筛选机制。

### 研究内容与结论

研究人员以μ-阿片受体（μ-opioid receptor, MOR）为模型靶标，通过EV-SELEX成功筛选出一种高亲和力、高特异性且具激动功能的DNA适配体Dapt-μR（K_d ≈ 28 nM）。该适配体在未经遗传或化学修饰下，在异源HEK293细胞和原代哺乳动物中枢纹状体神经元中均表现出类似吗啡的MOR激动活性，且该活性可被纳洛酮（MOR拮抗剂）部分阻断。在体内，Dapt-μR鞘内注射可产生镇痛效应。研究表明，EV-SELEX是一种高效筛选靶向GPCR的强效DNA适配体的方法，有助于促进未表征GPCR的探索及相关疾病的治疗药物开发。该论文发表于《Communications Biology》。

### 主要关键技术方法

1. **细胞工程与诱导表达系统**：利用Flp-In T-REx 293细胞系，以四环素（tetracycline, Tet）依赖性方式稳定表达N端HA标签的MOR（F293-HA-MOR），实现靶标可控表达。
2. **EV-SELEX筛选流程**：包括三步循环——对未诱导细胞进行反筛选去除非特异性结合ssDNA；对诱导表达MOR的细胞进行正筛选使ssDNA结合靶标；通过收集细胞分泌的含MOR-DNA复合物的EV（如外泌体，30–150 nm）富集候选适配体。
3. **适配体结合与功能分析**：包括荧光标记适配体的共定位分析、基于GloSensor的cAMP生物测定（实时监测MOR介导的cAMP抑制）、钙成像（fura-2荧光法测量原代神经元Ca²⁺内流）以及von Frey机械痛阈测试（C57BL/6NCr小鼠鞘内给药）。

### 研究结果

**Selection of MOR-bound DNA aptamers by EV-SELEX**
研究人员通过EV-SELEX在4轮筛选后从ssDNA文库中获得MOR靶向适配体Dapt-μR（Clone 1），其含量比达12.3%，而改良Cell-SELEX（iCell-SELEX）需24轮才获0.95%比例。EV-SELEX还富集了与Clone 1仅差1–2碱基的6个相似序列。高通量筛选表明EV-SELEX效率显著提高。

**Validation of EV-SELEX**
实验验证了EV-SELEX依赖的关键生理过程：Tet诱导F293-HA-MOR细胞表达HA-MOR（约75 kDa，N-糖基化形式）；EVs含标志蛋白CD9/CD63/CD81，NTA（纳米颗粒追踪分析）显示平均粒径211.2 nm；蔗糖密度梯度超离心中HA和CD63共定位。qPCR显示Dapt-μR在Tet诱导细胞中分泌量在24–26 h显著增加（6倍），证实DNA-受体复合物经内吞并随EV分泌。

**Binding ability of Dapt-μR to MOR expressed on the cell surface in vitro**
Dapt-μR对HA、FLAG、Myc标签无差异结合，证明其识别MOR本身而非标签。共定位实验显示T-Dapt-μR与MOR共染。Dapt-μR仅结合Tet诱导的F293-HA-MOR细胞，而不结合HA-DOR或HA-KOR细胞，说明其受体特异性。SNAP-tag活细胞成像证实Dapt-μR结合细胞膜表面MOR，而Scramble对照无结合。

**Agonistic action of Dapt-μR on MOR in vitro**
在稳定表达GloSensor和HA-MOR的293T细胞中，F-Dapt-μR结合K_d为28.3 nM。在福斯高林（forskolin）升高cAMP背景下，Dapt-μR剂量依赖性地抑制cAMP积累（EC₅₀ = 21.4 nM）。100 nM Dapt-μR与100 nM吗啡抑制效果相当（40–50%），且均可被10 μM纳洛酮部分逆转。

**Actions of Dapt-μR in neural tissues and cells**
在小鼠脊髓切片中，T-Dapt-μR特异性结合背角腹侧（MOR富集区），荧光信号面积显著大于Scramble对照。在原代大鼠纹状体神经元中，100 nM Dapt-μR降低K⁺去极化诱发的Ca²⁺内流峰值幅度（中位数17.1%），显著高于Scramble组（8.08%），该效应被纳洛酮部分阻断。剂量响应曲线拟合K_d = 45.2 nM。

**Analgesic action of Dapt-μR in vivo**
C57BL/6NCr小鼠鞘内注射100 pmol Dapt-μR后，von Frey测试显示机械痛阈值显著提高（镇痛作用持续约60 min），而等量Scramble无效果。

### 讨论与结论

讨论指出EV-SELEX通过利用靶标GPCR配体依赖性内吞及含受体EV的释放这一生物物理策略，克服了传统SELEX方法中适配体效力低及非特异性ssDNA去除不完全的问题。EV-SELEX仍为原型技术，未来可通过修饰核酸类似物、高通量测序（HST）及人工智能生物信息学进一步优化。Dapt-μR对MOR具高亲和力（~28 nM），与高亲和力抗体药物相当，其激动效力与吗啡接近且可被纳洛酮逆转，表明其作用于MOR配体结合位点。DNA适配体较RNA适配体化学稳定性更高、炎症反应性低，利于临床应用。但Dapt-μR的细胞信号机制（尤其β-arrestin通路）尚待研究。
**结论**：研究人员开发了EV-SELEX方法，能够通过功能性EV高效筛选出针对靶标GPCR且具有高亲和力、高特异性和类药活性的DNA适配体。该方法有望推动未表征GPCR的系统性探索以及目前不可治愈GPCR相关疾病的有效治疗药物开发。