《Materials Today Advances》：Utilizing chitosan nanoparticles for the delivery of biologics to the brain via intranasal route
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由于其选择性渗透性，血脑屏障（BBB）是脑靶向药物递送的主要障碍，尤其是对于大分子如蛋白质或核酸。鼻-脑递送（ntb）通过嗅觉和三叉神经通路提供了有希望的药物递送机会，与全身递送相比，可在脑组织和中枢神经系统（CNS）中达到有效浓度。在本研究中，研究人员利用了
由于其选择性渗透性，血脑屏障（BBB）是脑靶向药物递送的主要障碍，尤其是对于大分子如蛋白质或核酸。鼻-脑递送（ntb）通过嗅觉和三叉神经通路提供了有希望的药物递送机会，与全身递送相比，可在脑组织和中枢神经系统（CNS）中达到有效浓度。在本研究中，研究人员利用了由壳聚糖（CS）构成的聚合物纳米颗粒（NPs），这些颗粒进一步进行了化学修饰并装饰有转铁蛋白（Tf）作为靶向配体，以检查蛋白质的鼻-脑递送。本研究的目的是使用β-半乳糖苷酶（βGal）作为模型蛋白，评估带有或不带有转铁蛋白（Tf）修饰的壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）作为鼻内平台用于鼻-脑蛋白质递送。研究人员对合成的壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）和转铁蛋白修饰的壳聚糖纳米颗粒（Tf-CS NPs）的理化特性、释放动力学、细胞摄取和通过上皮细胞层的渗透性进行了评估。负载β-半乳糖苷酶（βGal）的壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）和转铁蛋白修饰的壳聚糖纳米颗粒（Tf-CS NPs）分别显示粒径为120?±?16?nm和142?±?21?nm，包封效率为61?±?9%和53?±?6%。转铁蛋白（Tf）修饰增强了体外细胞摄取，并在上皮渗透性方面显示出有利趋势，24小时后77?±?10%的蛋白质负载被转运，而未修饰的壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）为54?±?24%。使用含有模型蛋白β-半乳糖苷酶（βGal）的荧光标记纳米颗粒评估了纳米系统在鼻内给药后到达中枢神经系统（CNS）的能力。在小鼠中鼻内给予黏液稳定、未修饰的壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）后，1小时后在脑脊液（CSF）中检测到约15%的给药荧光标记纳米颗粒和5.5%的具有酶活性的β-半乳糖苷酶（βGal）。结果表明，壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）可用于成功地将完整蛋白质递送至大脑。
**论文解读文章**
血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的选择性渗透性是脑靶向药物递送的主要障碍，尤其限制了大分子（如蛋白质和核酸）的治疗应用。鼻-脑递送（nose-to-brain delivery, ntb）通过嗅觉和三叉神经通路，提供了一种非侵入性途径，避免了BBB的直接穿越，能实现药物在脑组织和中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的有效浓度。壳聚糖（chitosan, CS）因其生物相容性、生物降解性和黏膜粘附性，是制备用于ntb递送的聚合物纳米颗粒（nanoparticles, NPs）的理想材料。然而，CS NPs在鼻内蛋白质递送中的应用仍面临酶降解、黏液清除等挑战。转铁蛋白（transferrin, Tf）作为靶向配体，可通过与鼻上皮细胞广泛表达的转铁蛋白受体结合增强递送效率。本研究旨在评估CS NPs和Tf修饰的CS NPs（Tf-CS NPs）作为鼻内平台用于蛋白质递送的能力，以β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, βGal）为模型蛋白，系统考察其理化特性、体外性能及体内脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）递送能力。论文发表在《Materials Today Advances》。
研究人员开展研究时采用的主要关键技术方法包括：通过离子交联法（ionotropic gelation）制备CS NPs，使用无铜点击化学（copper-free click chemistry）将Tf共价偶联至CS表面；利用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和激光多普勒测速法测定粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）和ζ电位；通过βGal酶活性测定计算包封效率；采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察形态；使用荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy, FCS）、荧光寿命成像显微镜（fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）和单粒子追踪（single particle tracking, SPT）分析人工鼻黏液（artificial nasal mucus, ANM）中的纳米颗粒稳定性；以人鼻鳞癌细胞系RPMI 2650为模型，在传统液体培养和空气-液体界面（air-liquid interface, ALI）培养条件下进行细胞摄取和渗透实验；体内实验使用C57Bl/6N小鼠（雄性，6-8周龄，购自Charles River Laboratories），经鼻内或静脉给药后1小时收集CSF，通过荧光强度和酶活性定量纳米颗粒和βGal。
研究结果如下：
**3.1 理化特性（Physicochemical characterization）**：通过离子交联法成功制备了CS NPs和Tf-CS NPs，负载βGal后粒径分别为120?±?16 nm和142?±?21 nm，PDI分别为0.196?±?0.021和0.224?±?0.047，ζ电位分别为21.9?±?1.8 mV和16.1?±?2.2 mV，包封效率分别为61?±?9%和53?±?6%。Tf修饰导致粒径增大和ζ电位降低，归因于表面糖蛋白的屏蔽效应。释放动力学实验显示，在5%葡萄糖和人工鼻液（artificial nasal fluid, ANF）中，CS NPs持续释放βGal，Tf-CS NPs在ANF中释放更慢，表明Tf屏蔽增强了离子强度环境下的胶体稳定性。
**3.2 黏液渗透（Mucus permeation）**：通过人工鼻黏液（ANM）覆盖的Transwell膜渗透实验，CS NPs和Tf-CS NPs均能缓慢通过黏液层，累积渗透量随时间趋于一致。FCS和FLIM分析表明，在ANM中CS NPs保持稳定，约64%的ATTOGal仍与纳米颗粒结合；Tf-CS NPs在30分钟内部分释放蛋白，但约三分之二仍保持颗粒关联。研究指出，黏液层厚度（约1 mm）大于生理黏液（5-100 μm），因此渗透实验提供定性比较而非定量预测。
**3.3 体外性能（In vitro performance）**：MTT实验证实，空载和βGal负载的CS NPs及Tf-CS NPs在25-100 μg/mL浓度下对RPMI 2650细胞无显著毒性。流式细胞术显示，在液体培养和ALI培养中，CS NPs和Tf-CS NPs均显著增强细胞摄取，Tf修饰进一步提高摄取量，但ALI培养中绝对值较低，归因于黏液屏障和转铁蛋白受体表达降低。共聚焦显微镜观察ALI培养的横断面，发现Tf-CS NPs在4小时后更倾向于上皮层基侧分布，提示更快转运。渗透性实验显示，24小时后Tf-CS NPs转运77?±?10%的βGal，CS NPs转运54?±?24%（与无细胞对照相比），尽管差异未达统计学显著性，但Tf修饰呈现有利趋势。
**3.4 体内实验（In vivo experiments）**：小鼠鼻内给予非修饰CS NPs（用ATTORho6G标记）后1小时，CSF中检测到约15%的给药荧光纳米颗粒和5.5%的活性βGal（通过酶活性测定）。静脉给药后CSF中未检测到纳米颗粒或βGal。结果表明CS NPs能通过鼻内途径将完整且具酶活的蛋白质递送至CSF，证明了该平台的体内潜力。
总结讨论部分：研究证实CS NPs在鼻内递送完整蛋白质方面具有可行性，Tf修饰虽能增强体外细胞摄取和上皮渗透，但也降低了黏液稳定性。体内实验仅采用非修饰CS NPs，因其在黏液中稳定性更好。未来需要优化Tf修饰策略以提高黏液耐受性，并开展多时间点药代动力学研究。研究结论翻译：本研究制备了带有和不带有转铁蛋白（Tf）作为靶向配体的壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）用于鼻内大分子递送。离子交联法的温和条件产生了稳定的纳米颗粒，具有高蛋白包封效率和有利于鼻-脑递送（ntb）的理化特性。CS NPs和Tf-CS NPs均表现出持续的β-半乳糖苷酶（βGal）释放，并能与人工鼻黏液（ANM）相互作用并渗透。Tf修饰增强了细胞摄取并在上皮渗透性方面显示出有利趋势，但降低了在黏液中的稳定性。相比之下，CS NPs能够穿过覆盖黏液的鼻上皮细胞层，被转运至脑脊液（CSF），并递送完整的蛋白质。鼻内给药后，未修饰的CS NPs到达CSF，并检测到具有酶活性的βGal，支持CS NPs平台用于鼻-脑递送（ntb）完整蛋白质的潜力。未来研究将进一步明确CS NPs介导的蛋白质递送的在体动力学，并评估Tf修饰与治疗相关蛋白质的潜在附加值。总体而言，本研究证明基于壳聚糖的纳米颗粒能够保护并运输完整模型蛋白穿过与鼻内递送相关的关键屏障，支持其作为生物制剂鼻-脑递送（ntb）通用平台的潜力。
