基于肺泡芯片平台模拟卷烟烟雾诱导的肺血管功能障碍

《Materials Today Bio》：Modelling cigarette smoke-induced lung vascular dysfunction using an alveolus-on-chip

　　

肺泡是肺部气体交换的核心部位，肺泡损伤是多种肺部疾病的特征。理解肺泡微血管动力学以及上皮-内皮相互作用对于准确模拟肺泡生理及其在慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)等肺部疾病中的功能障碍至关重要。在本研究中，研究人员展示了一种开放式、无膜肺泡芯片平台，该平台纳入了由原发性人肺内皮细胞和周细胞自组装形成的可灌注三维血管网络，并与肺泡上皮2型细胞（Alveolar Epithelial Type 2, AEC2）进行共培养。这些血管网络在持续流动条件下6天内形成，并可保持至少12天的稳定性。周细胞的加入支持了类毛细血管样血管的形成，并增加了EDNRB1基因的表达，该基因在肺泡微血管内皮细胞中富集。此外，与二维内皮单层相比，三维内皮网络中CD31基因表达更高，提示细胞-细胞黏附增强。单核细胞可成功灌注通过血管网络，拓展了该平台在研究肺部疾病中免疫相互作用的潜力。将AEC2单层直接培养于血管化水凝胶上，实现了生理学相关的细胞-细胞相互作用，无需人工膜阻隔，同时维持了气-液界面条件。重要的是，AEC2层暴露于全卷烟烟雾（Whole Cigarette Smoke, WCS)导致下层血管网络解体，而在没有AEC2的情况下未观察到该效应。该芯片模型为研究肺泡中的血管-上皮串扰、烟雾诱导的肺损伤以及免疫细胞募集提供了人源相关系统，为未来疾病建模和药物测试应用提供了有价值的平台。

该研究旨在解决肺疾病体外建模中的关键瓶颈问题。肺泡-毛细血管区室是执行气体交换的动态复杂微环境，而卷烟烟雾（Cigarette Smoke, CS)是COPD的首要危险因素。现有研究表明，长期暴露于CS可导致肺泡壁进行性破坏即肺气肿，同时破坏肺微血管屏障完整性。研究人员近期发现，在形态学完整的肺泡隔中，肺气肿患者已出现微血管内皮细胞丢失，且该现象先于肺泡上皮细胞丢失发生，提示CS可能通过影响血管腔室而阻碍受损上皮的修复。然而，CS对微血管的影响是直接还是间接介导、涉及哪些细胞串扰，目前尚不清楚。现有肺器官芯片模型多依赖内皮单层，无法准确表征肺毛细血管的表型、组织和功能，且缺乏采用来源于肺部疾病患者的原代细胞组合的模型。为此，研究人员开发了一种纳入原发性肺内皮细胞和周细胞形成可灌注三维稳定网络、并与原代肺泡上皮细胞共培养的肺泡芯片，以建立人源相关的COPD体外模型。该论文发表于《Materials Today Bio》。

研究人员采用的关键技术方法包括：从接受肺癌切除术或肺减容手术的患者肺组织（经荷兰莱顿大学医学中心生物样本库批准）中分离原代细胞；基于微计算机数控铣削聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylacrylate, PMMA)并结合微柱结构设计的开放式肺泡芯片平台；利用纤维蛋白-胶原水凝胶包埋内皮细胞和周细胞，通过rocking平台产生静水压力梯度实现双向灌注培养；采用流式细胞术进行细胞表征；通过量子点标记荧光珠和钙黄绿素-AM标记THP-1单核细胞进行灌注性实验验证；应用定量PCR分析血管相关基因表达；以及建立全卷烟烟雾暴露系统（3R4F参比卷烟，1 L/min流速）模拟体内吸烟暴露。

**原代细胞分离与芯片平台表征**

研究人员从宏观正常的肺肿瘤远距组织（主要来源于非小细胞肺癌患者，包括腺癌和鳞状细胞癌，部分为肺转移灶）中分离内皮细胞和周细胞，并采用HTII-280⁺分选分离AEC2细胞。经CD31磁珠分选的内皮细胞在含TGF-β信号抑制剂SB431542和Rho激酶抑制剂Y-27632的条件下扩增，以防止自发内皮-间充质转化并维持增殖能力。流式细胞术验证，第2代扩增的内皮细胞约97%为CD31⁺/PDGFRβ^?，周细胞约92%为NG2⁺/PDGFRβ⁺。芯片平台采用空气等离子体处理和多巴胺涂层以增强水凝胶黏附，通过混合内皮细胞、周细胞与纤维蛋白原-凝血酶-鼠尾胶原Ⅰ型制备细胞负载水凝胶进行灌注培养。

**血管网络形成与周细胞作用**

为验证周细胞对血管网络形成的必要性，研究人员比较了有无周细胞条件下内皮细胞的网络形成能力。结果显示，周细胞的加入显著降低了血管直径（p < 0.001），使血管结构更接近肺泡内约10 μm直径的毛细血管生理尺寸。第6天即可形成连续的自组装内皮-周细胞血管网络，并保持至第12天，CD31表达证实内皮表型维持。早期即观察到周细胞紧密包裹CD31⁺内皮样结构。值得注意的是，来自轻度和重度COPD患者的内皮细胞同样能够形成血管网络，但约18%供者的内皮细胞无法形成网络，且若分离过程中间充质细胞去除不充分（CD31表达下降、PDGFRβ升高），则网络形成失败。周细胞在网>络中的分布并非随机，而是与内皮血管结构紧密相邻。

**血管网络细胞表型特征**

为表征三维血管网络中内皮细胞的表型特征，研究人员比较了二维内皮单层与三维无周细胞网络、以及三维有周细胞网络与无周细胞网络中的基因表达差异。结果显示，三维网络中CD31表达显著高于二维单层（p=0.0283），提示三维培养更好地维持内皮表型和细胞-细胞黏附。与二维单层相比，LYVE1（宏观血管）、CLDN5（微血管）、GPIHBP1/PTPRB（gCap微血管）、EDNRB1（aCap微血管）和BMP6（肺泡修复）等基因表达无显著差异。而在三维网络中加入周细胞后，EDNRB1表达显著上调（p=0.0496），其他标志物无显著变化。周细胞本身不表达EDNRB1，二维周细胞单层亦不表达任何内皮标志物，因此该上调效应来源于内皮细胞本身。此外，MRC-5胎儿成纤维细胞不能支持内皮网络形成，反而导致网络结构破坏，而周细胞则维持连续网络结构，表明周细胞对血管网络的支持具有特异性。

**网络灌注功能验证**

研究人员通过荧光微珠和活细胞灌注实验验证血管网络的生理功能。第6天成熟的内皮-周细胞网络可成功灌注2 μm荧光微珠，钙黄绿素-AM标记的THP-1单核细胞亦可在数秒内分布于整个网络并从对侧流出，时间分辨强度投影显示明确的细胞运动轨迹。网络灌注失败时，微珠滞留于入口侧微柱间隙无法进入凝胶腔室。该结果证实工程化血管网络具备灌注小颗粒和活免疫细胞的能力。

**AEC2单层与血管网络的共培养**

为模拟肺泡上皮-血管的空间关系，研究人员在第5天血管网络形成后，于水凝胶表面播种AEC2细胞形成单层。共培养体系可维持至第12天，免疫荧光显示完整的pro-SFTPC⁺ AEC2单层与CD31⁺内皮网络共存，三维重建清晰展示两者的空间构象。有趣的是，靠近内皮网络的AEC2呈现更高的pro-SFTPC表达水平，提示内皮细胞可能对AEC2功能具有调控作用。该无膜共培养系统实现了直接的细胞-细胞相互作用，同时保持了气-液界面条件。

**全卷烟烟雾暴露效应**

利用开放式芯片设计，研究人员建立了全卷烟烟雾暴露模型。内皮细胞和周细胞包埋于水凝胶后4小时播种AEC2，以在WCS暴露前（第2天）形成完整AEC2单层，确保仅AEC2直接接触烟雾而非血管网络。芯片连续5天每日暴露于3R4F参比卷烟WCS或空气对照（每次4-5分钟，后续通风10分钟），第6天分析。结果显示，空气暴露组维持连续的CD31⁺/NG2⁺血管网络，而反复WCS暴露导致内皮-周细胞网络完全解体，表现为血管不连续或CD31⁺细胞小团块，且该效应具有供者依赖性。然而，直接暴露于WCS的AEC2单层形态保持完整。关键预实验表明，在无AEC2存在时，反复WCS暴露不破坏血管网络完整性，提示AEC2介导了WCS诱导的血管损伤。值得注意的是，将反复WCS暴露的AEC2插入式培养基转移至血管化芯片培养，未引起血管床解体，暗示 responsible mediators可能为短效因子和/或仅作用于极短距离。

**讨论与结论**

该研究开发的开放式肺泡芯片模型成功整合了可灌注的、稳定的三维内皮-周细胞血管网络与原代AEC2共培养体系，为研究肺泡微血管动力学、上皮-内皮串扰及烟雾诱导损伤提供了人源相关平台。与依赖多孔膜分隔的传统肺芯片模型不同，该无膜设计消除了物理屏障，使AEC2直接与血管化水凝胶接触，更真实地模拟了肺泡内的生理空间关系，同时支持气-液界面的建立。

模型的主要优势包括：使用原代人肺细胞而非永生化或干细胞来源细胞，更接近人体生理；周细胞的整合对形成类毛细血管尺寸血管、维持微血管稳定性至关重要；双向灌注流动虽非生理性单向流动，但既往研究显示其对血管形成的影响与单向流动相当；开放式结构便于空气传播物质暴露，更贴近吸烟者的真实暴露情景。

研究也存在局限性：目前尚不能模拟呼吸相关的周期性机械拉伸，这是肺芯片系统增强生理相关性的重要因素；基于静水压力梯度的双向灌注对剪切力控制有限，可能影响内皮屏障完整性；供者间内皮细胞血管形成能力差异较大（约50%供者能稳定形成网络），现已通过凝胶萌芽预筛选和优化组织处理流程改善；性别分布偏女性可能影响结果普适性；AEC2向AEC1的分化控制仍需进一步开发以增强模型复杂度。

未来发展方向包括：整合气流和单向介质流动及传感器；纳入功能屏障完整性和通透性检测；实现AEC2向AEC1的控制分化以完善肺泡细胞组成；引入原代成纤维细胞补充肺泡微环境；延长烟雾暴露时间以区分急性和慢性效应；结合促纤维化刺激模拟纤维化发生；以及探索免疫细胞在肺泡上皮单层的整合以研究炎症 innate免疫在肺部疾病中的作用。

研究结论表明，研究人员开发了一种用于空气传播暴露研究的开放式肺芯片模型，该模型采用患者来源细胞构建了可灌注且稳定的内皮-周细胞血管网络。该模型部署了无膜AEC2共培养，培养于血管床上方，能够在卷烟烟雾暴露期间更好地模拟上皮-毛细血管相互作用。与二维系统不同，该芯片平台允许在动态微环境中分析多细胞串扰和血管相互作用，这些在常规培养模型中难以实现。该平台特别适用于空气传播暴露研究和局部免疫细胞募集与活化研究，可作为研究肺部疾病和最终筛选药物靶点的补充工具。