《Materials Today Bio》：Sequential Release of N-butylphthalide via Multifunctional Hydrogel for Rapid Neuroprotection and Sustained Neural Repair after Traumatic Brain Injury
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及时在急性期开展神经保护治疗，并结合亚急性期与慢性期的持续神经修复策略，对创伤性脑损伤（TBI）后的功能恢复至关重要。然而，目前鲜有药物干预能通过单次给药实现跨阶段调控。因此，开发具有顺序神经保护和神经修复能力的药物递送系统迫在眉睫。研究人员制备了一种可注射多
及时在急性期开展神经保护治疗，并结合亚急性期与慢性期的持续神经修复策略，对创伤性脑损伤（TBI）后的功能恢复至关重要。然而，目前鲜有药物干预能通过单次给药实现跨阶段调控。因此，开发具有顺序神经保护和神经修复能力的药物递送系统迫在眉睫。研究人员制备了一种可注射多功能甲基丙烯酸化海藻酸盐水凝胶（AlgMA），该水凝胶整合了环糊精包合物（用以改善正丁基苯酞（NBP）的低溶解性）和蔗糖乙酸异丁酸酯（SAIB）储库（用以延长滞留时间并实现延迟释放）。将该水凝胶单次植入TBI后腔体，在小鼠模型中发挥了顺序治疗效果：在急性期快速释放NBP以减轻铁死亡（ferroptosis），随后通过持续释放调节微胶质细胞极化，最终增强晚期神经可塑性。研究人员通过临床数据库分析、小鼠转录组分析和在体实验，确认铁死亡是TBI病理生理过程的关键驱动因素。进一步的网络药理学分析、分子对接和体外实验表明，NBP通过GSK-3β-Fyn-Nrf2通路减轻TBI诱导的铁死亡。综上，该研究提供了一种具有可控NBP释放的多阶段治疗平台用于TBI干预。
创伤性脑损伤（TBI）是全球重大公共卫生问题，也是各年龄段人群死亡和长期残疾的主要原因之一。尽管TBI管理方面已取得显著进展，如颅内压监测精细化、减压手术优化、镇痛镇静方案标准化以及脑灌注和氧合维持改善，但TBI后的临床结局仍存在相当大的变异性。当前治疗策略主要为支持性治疗，尚缺乏能够有效阻止TBI病理进展的疾病修饰性药物治疗。这一困境凸显出一个关键治疗难题：TBI随时间动态演变，早期治疗聚焦于急性期的神经元保护，随着损伤进展至亚急性和慢性阶段，治疗策略逐渐转向促进微环境重塑和神经可塑性。然而，传统的药物依赖治疗方法往往无法实现药物暴露与阶段特异性治疗需求之间的时间匹配。
在TBI急性期，神经元死亡和继发性损伤级联主导病理进程，神经元保护是首要治疗目标。继发性损伤级联涉及氧化应激、线粒体功能障碍、炎症级联以及凋亡和坏死等多种细胞死亡形式。TBI后血脑屏障（BBB）破坏导致脑组织中铁异常蓄积，同时细胞内铁储存和转运途径失调。过量铁通过芬顿反应（Fenton chemistry）催化活性氧（ROS）生成，触发脂质过氧化链式反应，导致膜完整性受损，最终引起铁死亡性神经元死亡。铁代谢失调和铁死亡已成为TBI急性期后神经元丢失的关键贡献因素。
基于TBI急性期的病理机制，靶向治疗策略主要聚焦于：（A）抑制铁死亡并防止脂质过氧化损伤；（B）利用抗氧化剂激活核因子E2相关因子2（Nrf2）通路以清除有害ROS；（C）保护线粒体并调节代谢；（D）应用抗炎和免疫调节治疗。在亚急性至慢性期，治疗重点从限制损伤转向促进修复和重塑。此阶段自发修复程序启动，恢复日益依赖神经可塑性，尽管仍面临轴突再生受限、胶质瘢痕形成以及持续性促炎微环境等障碍。微胶质细胞极化对于调节突触重塑和可塑性至关重要，而更广义的微环境重编程进一步塑造环路重组和功能恢复。因此，亚急性和慢性期治疗策略聚焦于增强可塑性、突触重塑和神经发生，同时通过促进修复相关表型、减轻慢性炎症来调控免疫微环境。
理想的TBI疗法应兼顾两个阶段：通过靶向铁死亡等机制提供急性神经保护，并通过免疫调节和神经可塑性等促进亚急性和慢性期修复。这凸显了时间程序性递送策略的必要性。正丁基苯酞（NBP）是一种具有广泛生物活性的神经保护药物，包括抗氧化、线粒体保护、抗炎和改善微循环等作用。然而，在临床前和转化研究中，NBP最常采用全身给药方式。虽然急性期BBB通透性短暂增加时全身给药尚属可行，但随着BBB逐渐恢复且外周代谢降低脑组织药物可用性，在亚急性至慢性期维持治疗性脑内暴露变得愈发困难。因此，构建生物材料局部药物递送系统以实现NBP的靶向脑部递送和时间控制释放，成为解决该挑战的合理途径，也是克服TBI医学和工程学治疗困境的关键方向。
可注射水凝胶是具有三维网络结构的亲水性高分子材料，在神经损伤治疗中展现出显著潜力。其主要优势包括优异的生物相容性、原位凝胶化能力以及高效药物负载能力。这些水凝胶可封装多种治疗载体，包括小分子药物、蛋白质、外泌体和细胞，同时实现治疗因子的控释和局部微环境调控。重要的是，TBI后创伤性空腔的形成为原位生物材料植入和填充提供了天然空间和结构基础，使局部递送成为可行且合理的治疗策略。尽管已有进展，当前大多数设计强调持续释放或单一模式释放，仍未能充分匹配TBI的阶段依赖性治疗需求，尤其缺乏经系统设计和验证的双相（爆发加持续）释放系统来提供早期神经保护和长期修复导向调控。
为此，研究人员以TBI后可植入的创伤性空腔为独特递送位点，开发了一种可注射水凝胶平台用于NBP的局部递送。该系统通过结合急性期爆发释放和亚慢性期持续释放实现双相释放。急性期快速NBP释放靶向铁死亡通路和氧化应激反应，阻断继发性损伤级联以实现快速神经保护；亚慢性期持续NBP释放长期调控微胶质细胞极化方向，优化局部修复微环境，减轻慢性胶质炎症对神经可塑性的影响，促进突触重塑和神经功能重建。
为实现该治疗策略，本研究开发了分级分阶段释放复合水凝胶，整合可生物降解的药物负载水凝胶用于急性期NBP爆发释放，并利用SAIB储库实现亚慢性期药物持续释放，建立了降解-释放协同机制以确保药物释放速率与TBI病理进程精确匹配。该研究不仅开发了一种临床可转化的NBP负载复合水凝胶，还建立了针对TBI动态病理过程的可编程顺序释放设计范式，为阶段适应性神经治疗递送系统的开发提供了框架。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：利用重症监护医学信息市场（MIMIC-IV）数据库进行临床数据分析，采用Kaplan-Meier生存分析和时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线评估基线铁蛋白水平与TBI预后的关系；运用两样本孟德尔随机化（MR）分析，以_inverse-variance weighted（IVW）方法和MR-Egger回归评估循环微量营养素与TBI风险的因果关联，遗传工具来自欧洲血统人群全基因组关联研究（GWAS）汇总数据，TBI数据来自FinnGen联盟；下载Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中小鼠TBI模型（GSE79441）的转录组数据进行基因集富集分析（GSEA）；采用SwissTarget和SEA数据库获取NBP药物靶点数据，OMIM和GeneCards获取TBI相关靶点，通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，利用DAVID数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；运用AutoDock Vina进行NBP与关键靶蛋白的分子对接模拟；合成甲基丙烯酸化海藻酸（AlgMA），制备NBP/CD包合物和SAIB-NBP混合物，构建三种水凝胶体系（NBP/CD@Gel、NBP&SAIB@Gel和复合水凝胶NBP@Gel）；采用Feeney重物坠落法建立小鼠中度TBI模型，通过转棒实验和平衡木行走评估运动协调与平衡功能，新物体识别（NOR）实验评估认知功能；运用蛋白质印迹（Western blot）检测铁死亡、氧化应激和突触相关蛋白表达；通过DCFH-DA探针、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）测定评估氧化应激水平；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子水平；通过免疫荧光染色标记离子化钙结合接头分子1（Iba1）、CD16、CD206、突触后密度蛋白95（PSD95）和囊泡谷氨酸转运体1（VGLUT1）等标志物；进行组织学分析（H&E染色、尼氏染色）和体内安全性评估。
**研究结果**
**铁代谢和铁死亡是TBI的关键病理特征**：临床Kaplan-Meier分析显示高铁蛋白组TBI患者生存率显著降低，时间依赖性ROC曲线表明铁蛋白对TBI结局具有预后价值。孟德尔随机化分析提示血清铁与TBI风险存在因果关联，GWAS的SNP特异性及汇总估计支持这一正相关。小鼠急性期（第3天）TBI数据集（GSE79441）的差异表达分析显示铁处理和应激反应基因（如Steap3、Fth1、Ftl1、Nrf2、Cox2）显著改变，GSEA显示铁死亡、铁死亡调控和铁离子转运相关基因集正富集。Western blot验证TBI后STEAP3、NCOA4、ACSL4升高而xCT降低，NBP处理可逆转这些变化，表明铁死亡是TBI病理生理的关键组成部分和治疗靶点。
**网络药理学鉴定GSK-3β为NBP在TBI中的关键靶点**：NBP相关靶点与TBI治疗靶点交集获得80个共同基因，PPI网络揭示以GSK-3β为中心的高度连接模块。GO富集分析提示炎症反应和细胞表面受体信号通路为主要生物学过程，KEGG通路涉及氧化应激和炎症反应。分子对接显示NBP与GSK-3β的Val135附近疏水口袋有效结合，形成强疏水相互作用和氢键，结合亲和力为-6.3 kcal/mol，表明NBP可通过调控GSK-3β活性发挥神经保护作用。
**NBP通过GSK-3β-Fyn-Nrf2通路减轻脂多糖（LPS）诱导的铁死亡**：引入GSK-3β激活剂DIF-3和Nrf2抑制剂ML385进行机制验证。NBP显著纠正LPS诱导的GSK-3β-Fyn-Nrf2通路蛋白改变，DIF-3影响全部五项读数（GSK-3β、Fyn、Nrf2、HO-1、NQO1），而ML385仅影响Nrf2、HO-1、NQO1，支持NBP调控GSK-3β-Fyn-Nrf2通路。NBP逆转LPS诱导的GPX4、xCT降低及ACSL4、COX-2升高，DIF-3或ML385共处理部分削弱该效应。NBP降低ROS和MDA、恢复CAT和SOD活性，DIF-3或ML385部分逆转这些保护作用，证实NBP通过GSK-3β-Fyn-Nrf2轴抑制铁死亡。
**NBP负载可注射水凝胶的制备与理化表征**：
1H NMR光谱确证AlgMA化学结构，FTIR光谱验证NBP/CD包合物和SAIB-NBP混合物的成功构建。三种混合水凝胶均呈现多孔互联结构，孔径分布于71-121 μm，储能模量（G′）为250-550 Pa，应变和频率扫描显示稳定的粘弹行为，与脑组织模量匹配。NBP@Gel在PBS中14天保留27.7±2.7%初始质量，体外释放呈现第1天约56%的初始爆发释放，随后持续释放至14天累计约75%。体内荧光示踪显示水凝胶配方在植入后14天仍可见病灶区信号，支持慢性期持续药物递送。
**NBP@Gel促进小鼠TBI模型长期神经功能恢复和神经元修复**：实验时间线涵盖TBI后多时间点评估。转棒实验中，TBI显著缩短潜伏期至脱落时间，NBP@Gel随时间明显改善该指标，优于单独NBP、NBP/CD@Gel和NBP&SAIB@Gel组；平衡木行走实验中，NBP@Gel显著减少跌落次数。新物体识别实验显示NBP@Gel在第14天显著改善认知功能。脑组织大体观察显示NBP@Gel组第3天和第14天损伤面积最小。H&E染色显示NBP@Gel组皮层结构和神经元完整性维持最佳，尼氏染色证实其神经元保存最显著，存活神经元密度量化支持这一保护效应。
**NBP@Gel减轻TBI后氧化损伤和铁死亡相关改变**：第3天4-HNE免疫组化显示TBI组脂质过氧化显著增强，NBP和NBP@Gel显著降低其表达；MDA和ROS水平在TBI后升高，NBP和NBP@Gel显著降低，NBP@Gel在第14天显示更优的长期控制效果；SOD和CAT活性在TBI后受抑，NBP和NBP@Gel恢复其活性，NBP@Gel在第14天改善更显著。体外N2a细胞实验中，LPS诱导GPX4、xCT降低和ACSL4、COX-2升高，NBP和NBP@Gel均显著逆转，NBP总体效应更强；LPS增加ROS、MDA并降低CAT、SOD，NBP和NBP@Gel改善这些指标；Nrf2、HO-1、NQO1在LPS后降低，NBP和NBP@Gel恢复其表达。
**NBP@Gel促进TBI后持续的抗炎微胶质细胞表型转换**：免疫荧光显示TBI组Iba1
+CD16
+促炎微胶质细胞密度升高，NBP和NBP@Gel在第3天降低其密度，第14天NBP@Gel组减少最显著；Iba1
+CD206
+抗炎微胶质细胞在NBP和NBP@Gel组增加，第14天NBP@Gel维持更高密度。ELISA显示TBI后TGF-β和IL-10降低，NBP和NBP@Gel提高其水平，第14天NBP@Gel组更高。体外LPS诱导的BV2细胞中，NBP和NBP@Gel减少iNOS、增加CD206，促进向抗炎表型极化。
**NBP@Gel增强TBI后第14天突触连接**：免疫荧光显示TBI组PSD95和VGLUT1信号及共定位显著减少，NBP@Gel增加最为显著。间接共培养实验中，LPS处理的BV2细胞减少N2a细胞PSD95和VGLUT1表达，NBP和NBP@Gel恢复其表达；原代神经元MAP2免疫染色显示NBP和NBP@Gel部分恢复神经元形态和神经突起延伸。
**体内安全性评估表明NBP@Gel良好生物相容性**：CCK-8和活/死染色显示NBP和NBP@Gel对N2a细胞无细胞毒性。主要器官H&E染色未见明显组织形态学异常，血液生化和血液学参数（ALT、AST、ALB、LDH、RBC、WBC、HGB、MCH、MCHC）无异常变化。
**讨论**
研究人员构建了从铁代谢到TBI预后和治疗脆弱性的多层证据链。临床数据显示高铁蛋白与生存率降低相关，孟德尔随机化提示循环铁对TBI风险的潜在因果贡献。转录组分析揭示铁死亡和铁转运相关程序的协调富集，STEAP3作为TBI后差异表达基因参与铁还原，NCOA4介导铁蛋白自噬释放游离铁。实验验证TBI后NCOA4和STEAP3蛋白升高，伴随xCT/ACSL4的铁死亡相关改变。
NBP网络药理学分析鉴定GSK-3β为关键上游调控节点，分子对接支持NBP与GSK-3β的可行相互作用。机制上，GSK-3β作用于Fyn上游促进Nrf2核输出，从而限制Nrf2依赖性抗氧化基因程序。NBP调控GSK-3β-Fyn-Nrf2轴，增强Nrf2/HO-1/NQO1同时使铁死亡相关蛋白向有利方向转变。体内观察到TBI后第3天4-HNE升高被NBP和NBP@Gel显著降低，组织MDA/SOD检测支持第3天和第14天氧化损伤减轻，NBP@Gel在后期时间点显示更优优势。
以往NBP多通过静脉或腹腔注射给药，面临外周分布导致的脑内药物蓄积有限、BBB时空异质性使颅内暴露难以预测、有效持续时间短需频繁给药等局限。皮质挫伤和血肿清除后留下的手术可及空腔为局部植入可注射材料提供了位点。NBP@Gel实现了有效的急性神经保护：第3天显著降低脂质过氧化并改善抗氧化指标，与游离NBP疗效相当；同时通过"爆发+持续"释放设计，在亚急性至慢性期维持局部暴露以支持长期修复。水凝胶的粘弹性与脑组织模量（100-1000 Pa）匹配，具有良好的可注射性和形状适应性。
从设计角度，环糊精包合解决NBP低溶解性问题，SAIB储库通过高粘度和疏水性形成致密基质延缓药物扩散，实现约56%首日爆发释放后持续释放的双相曲线，与TBI急性到慢性的病理需求相匹配。行为学显示NBP@Gel随时间改善运动协调平衡并增强后期认知功能；组织学显示减少组织破坏和神经元丢失；微胶质细胞分析显示更有效抑制促炎特征、维持抗炎表型及更高TGF-β和IL-10水平；突触连接显示PSD95和VGLUT1信号及共定位增加，体外实验确认通过调控微胶质细胞极化促进突触标志物表达和神经元形态恢复。
**研究结论**
研究人员开发了一种可注射的NBP@Gel水凝胶用于TBI后原位植入。该水凝胶通过抑制早期铁死亡和后期支持神经元及突触可塑性实现全程治疗。其提供持续的局部药物递送，解决了TBI急性和慢性期治疗的双重挑战。NBP@Gel的治疗优势并非源于多种药理学药物的联合，而是使单一药物能够在TBI不同阶段发挥多靶点效应，包括急性期抗铁死亡保护、亚急性期免疫调节作用，以及后期对突触重塑和功能恢复的支持。从转化角度看，该设计凸显了基于单次给药贯穿疾病全程策略的潜在价值，即一种局部递送的药物可能在TBI不断演变的病理过程中提供分阶段的治疗获益。然而，长期生物相容性、更全面多维的评估策略以及更精确的药物释放控制等问题仍需进一步解决，以推动NBP@Gel的临床转化。
