《Materials Today Bio》：Triple-helical ligands for collagen-binding proteins improve cartilage extracellular matrix production in nasal chondrocytes
编辑推荐：
关节软骨细胞（articular chondrocytes）用于关节软骨修复受到供区并发症、增殖能力弱以及表型难以稳定维持等限制。因此，鼻软骨细胞（nasal chondrocytes, NCs）近年来作为替代细胞来源受到关注。为更好地确立NCs在组织工程中的
关节软骨细胞（articular chondrocytes）用于关节软骨修复受到供区并发症、增殖能力弱以及表型难以稳定维持等限制。因此，鼻软骨细胞（nasal chondrocytes, NCs）近年来作为替代细胞来源受到关注。为更好地确立NCs在组织工程中的潜力，研究人员探索了其对胶原结合整合素（collagen-binding integrins）、盘状结构域受体（discoidin domain receptors, DDRs）以及分泌性酸性富含半胱氨酸蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC）激活的响应，这些蛋白对于软骨稳态至关重要。针对上述胶原结合蛋白的配体被设计为三股螺旋肽（triple-helical peptides, THPs），该类肽模拟了胶原的生物学和结构特性，并通过共价键连接到聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）或海藻酸水凝胶中培养人NCs。与人脂肪组织间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）相比，NCs过表达软骨形成标志物，产生更高的Sox9核转位和II型胶原（type II collagen）产量。此外，THP配体显著提高了水凝胶中关键软骨细胞外基质成分的表达，在长达21天的培养期间，无论在RNA水平还是蛋白水平均有所改善。特别是，针对DDRs或SPARC的THP配体促进了糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）和胶原的沉积。进一步地，THPs在培养7天后限制了纤维软骨形成、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13, MMP13）表达以及软骨细胞肥大。该研究引入了一种仿生策略，通过模拟关键的细胞/胶原相互作用，驱动NCs体外工程软骨组织形成的早期阶段。该工作为将可获取的细胞来源与功能化生物材料相结合以修复关节软骨提供了初步尝试。
该研究聚焦于关节软骨修复的临床挑战，发表于《Materials Today Bio》。软骨组织因创伤后自愈能力差、随时间持续恶化并可进展为骨关节炎，而当前治疗手段存在侵袭性强、供区并发症风险高等问题。关节软骨细胞虽为首选种子细胞，但存在取材创伤、分离扩增困难及表型不稳定等缺陷。作为替代方案，鼻软骨细胞（NCs）具有经鼻隔微创活检获取、增殖能力强、细胞外基质（ECM）机械强度高及抗骨关节炎炎症信号等优势，已进入临床试验阶段。然而，NCs在二维扩增后会丢失软骨表型，需三维环境再分化。传统方法依赖骨形态发生蛋白2（BMP-2）、胰岛素和三碘甲状腺原氨酸（T3）组成的BIT鸡尾酒诱导再分化，但存在个体差异大的问题。
研究人员为探究胶原结合蛋白在NCs命运调控中的作用，选择PEG和海藻酸两种水凝胶作为细胞载体，通过共价修饰THP配体模拟天然软骨微环境中的细胞-胶原相互作用。具体而言，GFOGER肽段可结合α1β1、α2β1、α10β1和α11β1四种胶原结合整合素；VWFIII肽段（GPRGQOGVNleGFO序列）则可识别DDR1、DDR2及SPARC。研究首先证实NCs高表达整合素α10β1和DDR2，相比脂肪组织间充质干细胞（MSCs）具有更强的软骨形成标志物表达水平。在二维培养中，GFOGER促进NCs整合素依赖性黏附、铺展和迁移，VWFIII则特异性激活DDR磷酸化。三维培养体系中，THP功能化水凝胶显著促进Sox9核转位和II型胶原合成，其中VWFIII效果尤为突出。
主要技术方法包括：从16例鼻中隔成形术手术废弃物获取人鼻隔软骨样本（19-59岁，10男6女）；采用自动微波辅助固相肽合成法制备GFOGER、VWFIII及对照GPP10三种THP，并通过圆二色谱验证其三股螺旋构象；通过马来酰亚胺-巯基反应将THP共价结合于4臂PEG水凝胶（接枝率83%），或以碳二亚胺法将THP连接至海藻酸钠的羧基（接枝率57%）；采用活/死染色、鬼笔环肽/纽蛋白免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、二甲基亚甲蓝法测定硫酸化GAG含量、羟脯氨酸法定量胶原含量，以及基于Exploris 480质谱的蛋白质组学分析（数据存于MassIVE数据库MSV000100962）。
研究结果显示：
胶原受体与软骨标志物表达特征。新鲜分离的NCs与MSCs比较分析表明，MSCs主要表达ITGA1和ITGA11，而NCs显著高表达ITGA10；两种细胞均高表达DDR2和SPARC。NCs的SOX9、COL2A1和ACAN水平显著高于MSCs，而RUNX2和COL1A1较低，证实NCs具有更成熟的软骨细胞表型。二维扩增后NCs软骨标志物有所下降但不显著，提示仅部分丢失软骨表型。
胶原结合受体验证。镁离子依赖性细胞结合实验证实GFOGER通过胶原结合整合素介导NCs黏附；Western blot显示VWFIII可诱导DDR磷酸化激活，且NCs predominantly表达DDR2而非DDR1。细胞形态学观察显示GFOGER促进肌动蛋白聚合和细胞铺展，VWFIII产生中等程度细胞突起，而GFOGER还可显著增强细胞迁移能力。
水凝胶构建与细胞存活。PEG水凝胶通过THP末端半胱氨酸与4臂PEG马来酰亚胺的一步反应实现交联与细胞包封；海藻酸水凝胶则通过N端氨基与海藻酸羧基的EDC/NHS偶联实现功能化，且不影响钙离子螯合凝胶化能力。功能化海藻酸凝胶的弹性模量和溶胀比与未修饰组相当。活/死检测显示各THP组细胞存活率80%-85%，显著高于未修饰海藻酸组的71%。
Sox9转位与II型胶原沉积。PEG水凝胶培养7天后，GFOGER和VWFIII组的Sox9核转位比例分别达53%和67%，显著高于GPP10对照组（19%）；21天时仍维持显著优势。VWFIII组II型胶原沉积量增加8倍，GFOGER组也有提升但不显著。联合使用两种THP未产生协同增效。
NCs与MSCs软骨形成能力比较。二维扩增14天后，NCs的SOX9、COL2A1和ACAN表达显著高于MSCs，Ki67增殖标志也更高，而COL1A1和RUNX2较低。PEG水凝胶培养7天后，NCs的Sox9核转位和II型胶原产量均显著优于MSCs，但21周时差异缩小或消失，提示NCs早期软骨形成更快。
藻酸盐水凝胶中软骨标志物动态变化。BIT处理7天后，GPP10组SOX9、ACAN和COL2A1已显著上调（最高达66倍），但个体差异大；VWFIII组上述标志物增幅更显著且具统计意义。21天时各组标志物表达下降，可能反映从早期激活向成熟期的转变。Ki67表达下降印证了三维环境中NCs增殖减缓。
ECM组成定量与蛋白质组学分析。二甲基亚甲蓝法和羟脯氨酸法测定显示，VWFIII组硫酸化GAG和胶原含量分别较GPP10提高1.7倍和1.2倍。质谱鉴定出3589-3766种凝胶蛋白和858-1023种培养基蛋白，证实II型、VI型、IX型和XI型胶原及核心蛋白聚糖、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1（HAPLN1）等软骨ECM成分的存在。热图分析显示GFOGER上调蛋白聚糖核心蛋白和HAPLN1，VWFIII促进IX型和XI型胶原表达。两种THP均下调MMP13、I型胶原和X型胶原。
THP促进透明软骨ECM形成。火山图分析确认：凝胶中I型胶原和X型胶原显著下调，培养基中MMP13显著减少，VWFIII还降低骨桥蛋白水平。这些结果表明THP功能化水凝胶促进了透明软骨而非纤维软骨或肥大软骨表型。
讨论部分指出，该研究首次系统评估了靶向整合素和DDRs对NCs行为的影响。VWFIII通过激活DDR2（而非DDR1）发挥作用，但其是否通过捕获SPARC抑制炎症尚需进一步验证。NCs相比MSCs具有早期软骨形成优势，但更适用于自体移植策略。研究局限性包括供体变异大、未涉及机械刺激、未长期追踪ECM超分子组装等。未来可通过力学刺激、延长培养时间或联合其他生长因子进一步优化。
结论部分强调，该研究证实了人NCs在软骨工程中的强大潜力：NCs扩增后保留软骨标志物，三维培养后产生软骨ECM；在一周时点优于MSCs的软骨形成效率；GFOGER和VWFIII两种THP配体均能增强早期软骨形成和ECM沉积，同时抑制肥大、纤维软骨化和MMP13表达；特别是VWFIII通过靶向DDRs/SPARC成功诱导透明软骨组织形成。该仿生策略为关节软骨修复提供了结合可获取细胞来源与功能化生物材料的新途径。
