《Metabolism Open》：Angiogenic behavior of human umbilical vein endothelial cells in hydrogel containing lyophilized powder of decellularized adipose tissue from high-fat diet-fed or exercise-trained rats
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背景：肥胖常通过细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）重组导致血管生成受损，而运动训练对脂肪组织中的ECM重塑和毛细血管密度具有有益影响。然而，高脂饮食（High-Fat Diet， HFD）摄入和运动训练引起的血管生成与ECM变化之
背景：肥胖常通过细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）重组导致血管生成受损，而运动训练对脂肪组织中的ECM重塑和毛细血管密度具有有益影响。然而，高脂饮食（High-Fat Diet， HFD）摄入和运动训练引起的血管生成与ECM变化之间的关系仍不清楚。
目的：本研究旨在利用含有源自高脂饮食喂养或运动训练（Exercise-trained， EX）大鼠脂肪组织的脱细胞脂肪组织（Decellularized Adipose Tissue， DAT）粉末的三维水凝胶，评估人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells， HUVECs）的体外管样形成能力。
方法：从四个干预组（正常饮食（Normal Diet， ND）喂养的久坐组、HFD喂养的久坐组、ND喂养的EX组、HFD喂养的EX组）大鼠的腹股沟和附睾脂肪组织中制备DAT。将DAT掺入三维水凝胶中，并对DAT进行蛋白质组学分析。在DAT水凝胶中培养的HUVECs中评估管样网络形成。
结果：使用免疫印迹法鉴定了几种血管生成标志蛋白。与其他组相比，来自HFD-EX组的腹股沟DAT水凝胶显示出HUVECs更高的网络连接性、分支和长度发展。与ND组相比，在HFD组的附睾DAT水凝胶中也观察到了类似现象。HUVECs的管样网络形成在附睾水凝胶中比在腹股沟水凝胶中更显著，并伴有血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2， VEGFR2）、黏着斑激酶（Focal Adhesion Kinase， FAK）和血管内皮钙黏蛋白（Vascular Endothelial Cadherin， VE-cadherin）的蛋白表达增强。探索性蛋白质组学分析暗示了DAT组成存在脂肪库依赖性和干预依赖性差异。
结论：HUVECs的血管生成行为可能对HFD和运动训练相关的DAT组成变化敏感，且这种敏感性具有脂肪库依赖性。
本研究旨在探讨肥胖（通过高脂饮食诱导）和运动训练如何通过改变脂肪组织细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）的组成，进而影响血管生成过程。健康的脂肪组织扩张依赖于适当的毛细血管生成，以确保脂肪细胞功能和脂肪生成。然而，肥胖常伴随ECM重组，导致血管生成受损，而运动训练则对ECM重塑和毛细血管密度有积极影响。目前，高脂饮食和运动训练引起的ECM变化与内皮细胞血管生成能力之间的关系尚不清楚。为此，研究人员构建了一种含有源自不同干预大鼠脂肪组织的脱细胞脂肪组织（Decellularized Adipose Tissue， DAT）粉末的三维水凝胶模型，用以模拟ECM微环境，并评估标准内皮细胞模型——人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells， HUVECs）在该环境中的血管生成行为。这项研究对于理解脂肪组织扩张的病理生理机制，以及运动对代谢健康的潜在益处具有重要意义。相关成果发表于《Metabolism Open》期刊。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，建立了动物模型，将雄性Wistar大鼠分为正常饮食久坐、高脂饮食久坐、正常饮食运动训练和高脂饮食运动训练四组，干预9周。运动训练采用跑台训练方案。随后，从大鼠的腹股沟（皮下）和附睾（内脏）脂肪库中分离组织，并通过一系列物理化学处理（包括反复冻融、洗涤、酶消化和去垢剂处理）制备脱细胞脂肪组织（DAT），再经冻干研磨成粉。接着，将DAT粉末与胃蛋白酶消化液混合制备预水凝胶，经pH中和后，使用TrueGel3D交联系统（含硫醇化葡聚糖和细胞可降解交联剂）在37°C下聚合，形成三维DAT水凝胶。最后，将HUVECs接种于DAT水凝胶中，在添加血管内皮生长因子（Vascular End Growth Factor， VEGF）刺激后，通过Calcein AM荧光染色和图像分析软件（如ImageJ的Angiogenesis Analyzer插件）定量评估HUVECs的管样网络形成参数（如连接点、分支、长度、网格等）。同时，利用免疫印迹法分析HUVECs中血管生成、黏附和机械转导相关蛋白的表达，并采用液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， LC-MS/MS）技术对DAT粉末进行探索性蛋白质组学分析，以探究其组成差异。
**研究结果**如下：
**3.1. 运动和高脂饮食摄入对大鼠体重、脂肪组织质量和血液甘油三酯浓度的影响**
高脂饮食久坐组大鼠的总体重、腹股沟及附睾脂肪组织质量均高于正常饮食久坐组，而运动训练组（无论是正常饮食还是高脂饮食）的这些指标均低于其对应的久坐组。血液甘油三酯浓度变化趋势相似，高脂饮食久坐组高于正常饮食久坐组，运动训练组则低于对应的久坐组。这些结果验证了高脂饮食和运动训练对代谢参数的预期影响。
**3.2. HUVECs在DAT水凝胶中的存活率**
通过碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）染色评估，与不含DAT的水凝胶相比，在所有干预组来源的DAT水凝胶中培养的HUVECs，其PI荧光强度均显著降低，表明DAT水凝胶能维持较低的细胞死亡水平。免疫印迹分析显示，各组间凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达及其比值无显著差异，进一步证实了所有DAT水凝胶都能良好地维持HUVECs的存活。
**3.3. 四个干预组来源的DAT水凝胶中HUVECs的管样形成**
评估了源自四个干预组大鼠腹股沟和附睾脂肪组织的DAT水凝胶对HUVECs管样形成的影响。在**腹股沟来源的DAT水凝胶**中，与正常饮食久坐组、正常饮食运动训练组和高脂饮食久坐组相比，高脂饮食运动训练组（HFD-EX）来源的DAT水凝胶培养的HUVECs，其网络连接性指标（节点、连接点、片段和分支数量）以及网络形态学指标（总长度、片段长度和分支长度）均显著更高。网络成熟度指标（网格数量）在高脂饮食运动训练组也高于高脂饮食久坐组。这表明，在腹股沟DAT中，高脂饮食结合运动训练最能促进HUVECs的血管网络形成。在**附睾来源的DAT水凝胶**中，与正常饮食组（无论是否运动）相比，高脂饮食组（无论是否运动）来源的DAT水凝胶培养的HUVECs，其网络连接性、形态学和成熟度的大部分指标均显著增强。这表明，在附睾DAT中，高脂饮食条件本身就能增强HUVECs的血管网络形成。
**3.4. 管样形成的三维特征评估**
通过三维成像分析HUVECs网络在Z轴（厚度）方向的特性。在腹股沟DAT水凝胶中，各组间平均费雷特直径（Z轴）无显著差异，但尺寸分布直方图显示，在特定尺寸范围内（如50-60微米、60-70微米），运动训练组或高脂饮食组存在差异。在附睾DAT水凝胶中，同样未观察到平均费雷特直径的组间差异，但其尺寸分布峰值集中在更小的范围（10-20微米），且在不同尺寸范围内，干预组间存在特定差异。
**3.5. HUVECs在腹股沟与附睾来源DAT水凝胶中血管生成行为的比较**
综合比较显示，除末端数量外，HUVECs在附睾来源的DAT水凝胶中形成的所有血管生成相关指数（包括网络连接性、分支和长度）均显著高于在腹股沟来源的DAT水凝胶中。热图分析进一步直观显示，附睾DAT水凝胶在促进HUVECs血管生成方面具有显著更高的效力。
**3.6. DAT水凝胶中培养的HUVECs其血管生成相关标志物以及黏附和机械转导相关因子的表达**
蛋白质表达分析发现，在所有干预组中，培养于附睾DAT水凝胶的HUVECs，其VEGFR2和VE-cadherin的蛋白表达水平均显著高于培养于腹股沟DAT水凝胶的HUVECs。而CD31和α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin， α-SMA）的表达无显著差异。在黏附和细胞骨架相关蛋白（如整合素α6、整合素β1、Talin-1、Vinculin）的表达上，脂肪库或干预组间均无显著差异。机械转导信号蛋白方面，总FAK（t-FAK）在附睾DAT水凝胶培养的HUVECs中表达显著更高；磷酸化FAK（p-FAK）也呈现相同趋势但未达统计显著性。在特定干预条件下，附睾DAT水凝胶培养的HUVECs中，磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1和2（p-mTORC1、p-mTORC2）、总mTOR（t-mTOR）以及活性β-连环蛋白（active β-catenin）的表达也更高。然而，这些蛋白的磷酸化状态（磷酸化与总蛋白比值）在组间无差异。其他信号分子如Src、细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinase， ERK）、AKT的总量及磷酸化水平也未显示组间差异。
**3.7. 各干预组中DAT的蛋白质组学特征**
探索性蛋白质组学分析显示，腹股沟和附睾DAT的蛋白质组成存在明显差异。主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）表明，腹股沟和附睾DAT形成两个不同的聚类。在腹股沟DAT中，正常饮食运动训练组和高脂饮食久坐组的分布远离正常饮食久坐组，而高脂饮食运动训练组与正常饮食久坐组分布接近。在附睾DAT中，各干预组分布更为分散，久坐组和运动训练组形成不同的聚类。差异丰度蛋白数量分析进一步揭示了干预引起的DAT组成变化具有脂肪库特异性。
**3.8. 与增强的HUVECs网络形成相关的DAT中常见蛋白的提取**
通过韦恩图分析和数据整合，研究人员提取了与增强的HUVECs网络形成相关的候选蛋白。研究发现，在腹股沟HFD-EX DAT和附睾HFD DAT中共同高表达的蛋白包括Serpina3m（对应蛋白ID：F1LR92， A6JEQ4， Q63556）。脂肪库特异性蛋白包括：在腹股沟DAT中特异性高表达的胶原蛋白Col4a4和Col3a1；在附睾DAT中特异性高表达的Sel1l和Tlcd3b。热图显示，这些上调蛋白的表达模式与表型热图高度相似，即在相同干预条件下，许多蛋白在附睾DAT中的表达量高于腹股沟DAT。同时，研究也鉴定了一些在相关DAT组中表达降低的蛋白，但未发现共同下调的蛋白。基因本体（Gene Ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析提示，在腹股沟HFD-EX DAT中，富集了与血管生成、细胞骨架和ECM重塑相关的通路；在附睾HFD DAT中，则富集了与细胞骨架重塑相关的通路。
**讨论部分**总结如下：本研究成功构建了DAT水凝胶系统，该系统能有效支持HUVECs存活并诱导其形成管样网络。研究核心发现是HUVECs的血管生成行为对DAT的组成变化敏感，且表现出明显的脂肪库依赖性。具体而言，附睾（内脏）来源的DAT水凝胶比腹股沟（皮下）来源的更能促进HUVECs的管样形成，这可能与附睾DAT中VEGFR2、FAK和VE-cadherin蛋白表达更高有关。蛋白质组学分析进一步提示，附睾DAT中高表达的Col4a4和Sel1l等ECM相关蛋白可能是其促血管生成特性增强的原因。
与预期不完全一致的是，运动训练和高脂饮食对HUVECs血管生成行为的影响具有条件性和脂肪库特异性：仅在腹股沟DAT中，高脂饮食结合运动训练（HFD-EX）显示出最强的促血管生成效应；而在附睾DAT中，高脂饮食条件本身（无论是否运动）即能增强促血管生成效应。这些干预依赖性的差异并未伴随所检测的血管生成信号蛋白磷酸化状态的普遍改变，暗示DAT组成的变化本身可能是驱动HUVECs行为差异的关键。候选蛋白分析指向Serpina3m、Col3a1和Tpm4等分子可能在不同脂肪库和干预条件下调节血管生成，但其具体机制有待未来研究。
研究人员也指出了本研究的局限性：DAT水凝胶的体外系统无法完全模拟体内复杂的微环境（如活性氧、炎症细胞浸润等因素）；使用的HUVECs与脂肪组织内源内皮细胞存在固有异质性；未系统评估水凝胶的物理生化特性（如硬度、孔隙率等）对结果的影响；研究仅使用雄性大鼠，未考虑性别差异。未来的研究需要进一步量化DAT水凝胶的机械和结构特性，并探索性别因素对ECM介导的血管生成的影响。
**结论**部分翻译如下：研究结果表明，HUVECs能在含有来自高脂饮食喂养、运动训练或两者兼具的大鼠DAT的水凝胶中形成管样网络。HUVECs的管样形成在腹股沟HFD-EX DAT和附睾HFD DAT中显著增强。此外，与腹股沟DAT水凝胶相比，附睾DAT水凝胶导致HUVECs产生更显著的管样形成。因此，HUVECs的血管生成行为响应了不同的DAT组成而变化，而DAT组成因高脂饮食喂养单独或与运动训练结合而以解剖部位特异性的方式发生改变。尽管研究人员未能提供关于ECM与HUVECs血管生成行为之间关系的机制性见解，但据他们所知，这些关于HUVECs在由ECM成分组成的DAT水凝胶中血管生成行为的形态学结果是首次被报道。
