《Methods》：Cilia SubQ: a modular suite of semi- and fully automated pipelines for analysis of primary cilia and ciliary subdomains
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初级纤毛是保守的、天线状的感觉细胞器，从大多数脊椎动物细胞表面伸出。其核心功能是检测细胞外信号并将其转化为下游信号转导，对胚胎发生和组织稳态至关重要。纤毛在物理上与细胞质分离，并包含专门的亚区室，包括基体、过渡区和纤毛尖端，所有这些对其结构、功能和信号输出都至
初级纤毛是保守的、天线状的感觉细胞器，从大多数脊椎动物细胞表面伸出。其核心功能是检测细胞外信号并将其转化为下游信号转导，对胚胎发生和组织稳态至关重要。纤毛在物理上与细胞质分离，并包含专门的亚区室，包括基体、过渡区和纤毛尖端，所有这些对其结构、功能和信号输出都至关重要。破坏这些亚区室的纤毛基因突变可导致一系列发育障碍，统称为纤毛病（ciliopathies）。对这些亚微米级纤毛结构域的分析通常耗时、重复且易受用户偏倚影响。此外，用于亚结构域分析的自动化工具仍然有限，因此需要开发适用于健康和病理条件的新型、无偏且精确的分割工具。在此，研究人员（Elizabeth Menzel等人）介绍Cilia SubQ，这是一套适用于Zeiss arivis Pro的灵活流水线工具包，可实现初级纤毛、中心粒周物质（pericentriolar material）、基体、过渡区和纤毛尖端的分割，通过受控的人工干预将分析时间缩短约八倍。这些流水线基于研究人员新开发的Cilia.AI，这是一种深度学习模型，能以最少的人工校正识别初级纤毛。该套件还包括一个经过验证的脚本，用于生成动态图谱（kymographs）以评估哺乳动物初级纤毛中的鞭毛内运输（intraflagellar transport, IFT）动力学。Cilia SubQ文件和视频教程已通过开放科学框架（Open Science Framework, OSF）公开，网址为https://osf.io/hm38f/。总之，Cilia SubQ流水线兼容批量处理，提供高通量、可重复的初级纤毛及纤毛亚结构域定量分析，数据输出量更大且手动操作时间减少。
**论文解读：Cilia SubQ——初级纤毛及纤毛亚结构域自动化分析模块化流水线**
**研究背景与问题**
初级纤毛（primary cilium）是一种进化保守的、从多数脊椎动物细胞表面伸出的微小感觉细胞器，长度通常仅数微米，通过检测细胞外信号并调控下游通路（如Sonic Hedgehog（SHH）信号、G蛋白偶联受体（GPCRs）通路）在胚胎发育和组织稳态中发挥核心作用。纤毛结构上由微管轴丝包裹于纤毛膜内，包含多个功能亚结构域：基体（basal body，由母中心粒转化而来）、过渡区（transition zone, TZ，亦称纤毛屏障，分子筛选和运输的调控枢纽）以及纤毛尖端（ciliary tip, CT，SHH信号动态调控和IFT（intraflagellar transport）转向位点）。这些亚结构域的分子组成与功能异常是纤毛病（ciliopathies）——一组由纤毛基因突变引起的发育障碍——的关键病理基础。
然而，由于纤毛尺寸极小（通常<1 μm）、形态多样（长度、荧光标记强度差异大），传统手动定量分析需在大量视野中逐一计数纤毛、测量荧光强度，不仅耗时（重复性劳动）、易引入主观偏倚，且难以高效评估亚结构域（如过渡区仅几百纳米）。现有自动化工具（如CiliaQ、detectCilia、ACDC等）主要聚焦于全纤毛检测与形态测量，对亚结构域的自动化分割与定量仍不完善。因此，亟需一种模块化、高通量、无偏的分析平台，整合纤毛检测与亚结构域定量，以适用于健康与疾病状态下的系统研究。
**研究内容与结论**
为填补这一空白，研究人员开发了Cilia SubQ——一套基于Zeiss arivis Pro软件的半自动与全自动流水线套件，旨在显著减少手动操作时间、剔除主观偏倚并提供可追溯的批量分析。核心贡献包括：（1）训练并优化了深度学习模型Cilia.AI（目前版本v32），能高精度识别多种细胞系（小鼠胚胎成纤维细胞MEFs、视网膜色素上皮RPE-1细胞、人皮肤成纤维细胞）及小鼠脑组织切片中的初级纤毛（ARL13B?），检测成功率≥90%，且强度测量与手动定量无显著差异；（2）在此基础上构建了三条亚结构域专用流水线：SubQ_BB_DC（基体与子中心粒分割）、SubQ_TZ（过渡区分割）、SubQ_CT（纤毛尖端分割），分别实现了对基体（准确率~92.6% MEFs）、过渡区（AHI1标记准确率99.5%）和纤毛尖端（KIF7标记准确率82.5%）的自动化识别，平均分析时间缩短约8倍；（3）提供了纤毛长度分析（SubQ_Length，结合FIJI骨架化脚本）和IFT动力学分析（SubQ_Kymo，生成动态图谱）的补充工作流。该套件所有流水线文件、导出模块及视频教程已通过OSF公开。研究表明，Cilia SubQ能在保持定量精度的前提下大幅提升通量，为纤毛生物学及纤毛病研究提供高效、可扩展的自动化分析框架。论文发表在《Methods》。
**主要关键技术方法**
- **深度学习模型Cilia.AI**：在Zeiss arivis Cloud平台训练，基于手动标注的ARL13B阳性纤毛和非纤毛背景图像，经35轮迭代训练（共标注236张图像、1,819根纤毛），整合形态多样性（长纤毛、短纤毛、异常形态）数据集，最终版本Cilia.AI v32以“Deep Learning Segmenter”模块导入Zeiss arivis Pro。
- **Zeiss arivis Pro流水线**：利用Blob Finder分割点状结构，结合距离计算、形态扩张、父-子对象关系等步骤，实现基体（基于γ-微管蛋白或Centrin-2）、过渡区（基于AHI1或TMEM67）、纤毛尖端（基于KIF7或IFT81）的自动识别。
- **批量分析与数据导出**：将MIP（最大强度投影）图像保存为SIS文件，通过批处理模块同时运行多条流水线，并采用专用导出流水线提取平均荧光强度、投影面积等参数。
- **样本来源**：训练与验证细胞系包括野生型及基因编辑MEFs（Csnk2a1敲除）、RPE-1细胞、人皮肤成纤维细胞，以及P31-P32 Arl13b-mCherry转基因小鼠脑切片。
**研究结果**
*2.1 开发并优化Cilia.AI模块以实现初级纤毛的精确识别*：通过扩展训练数据集（涵盖野生型MEFs、RPE-1、人皮肤成纤维细胞以及经siRNA或药物处理所致长短异常纤毛），Cilia.AI v32在未见过的测试集上平均检测成功率≥90%（含部分检测为97%），ARL13B荧光强度测量与手动定量无显著差异。此外，经SAG（SMO激动剂）处理后，Cilia.AI能可靠检测到SMO（SHH正调控因子）的累积和GPR161（SHH负调控因子）的减少，证实其在信号通路定量中的适用性。在脑切片中，Cilia.AI检测约69%的纤毛（含部分检测达87%）。手动分析速度提升约7.5倍。
*2.2 基体与子中心粒的分割与分析*：SubQ_BB_DC流水线以Cilia.AI识别的纤毛为参照，通过Blob Finder（基于γ-微管蛋白或Centrin-2）和距离函数识别最近及次近的中心粒结构，自动标记基体和子中心粒。在MEFs中正确检测92.61%的基体；在RPE-1细胞中，以Centrin-2为标记时正确率82.39%，且荧光强度定量与手动一致。提供子中心粒识别（MEFs中87.1%）。
*2.3 纤毛屏障（过渡区）流水线的开发与验证*：SubQ_TZ流水线识别AHi1或TMEM67标记的过渡区信号。通过扩张基体选区与纤毛交界处创建“过渡区区域”，约束Blob Finder输出仅保留距离基底体最近的信号。对AHI1标记，正确率99.5%；对TMEM67标记（背景噪声较高）经简单校正后达98.75%，强度与面积定量与手动无差异。
*2.4 纤毛尖端亚结构域流水线的设计与验证*：SubQ_CT流水线基于基体识别和Blob Finder（KIF7或IFT81），通过父-子关系分类及迭代距离过滤去除近端非尖端信号。KIF7尖端识别率82.45%，IFT81识别率83.05%，FUI/面积定量与手动一致。指出在无SHH激动剂时单一SHH标记受限，建议采用IFT81等稳定标记作为参考框架。
*2.5 关于启动流水线、SIS文件及批量分析的关键说明*：所有流水线需先导入Cilia.AI模型（“.czann”文件）进行“启动”，然后调整Blob Finder参数，验证后保存为SIS文件用于批量分析。导出数据使用专用导出流水线，确保输出目录与SIS一致。
*2.6 利用Cilia.AI检测进行纤毛长度分析*：SubQ_Length流水线从任何SubQ流水线中导出标记为“Primary cilia OUTPUT”的对象，输出蒙版TIFF图像，后在FIJI通过骨架化脚本批量测量长度，与手动测量结果一致，且三条亚结构域流水线的长度测量可互换。
*2.7 SubQ_Kymo：用于初级纤毛运输分析的动态图谱生成*：在Zeiss arivis Pro中对IFT88-GFP和ARL13B-mCherry转染的MEFs进行活细胞成像（250 ms/帧，30 s），手动标注单个纤毛后，执行SubQ_Kymo脚本生成动态图谱，经像素重采样和位深转换后输出.tif文件用于手动定量。测得IFT88顺向和逆向运输速度及事件数量与文献报道相符。
**讨论与结论**
讨论部分指出，Cilia SubQ是一套研究人员可根据实验需求调整的流水线和脚本集合，旨在简化重复性任务并提供无偏、可追溯的大数据集分析。尽管Zeiss arivis Pro软件非开源，但所提供的流水线文件、脚本及教程可在广泛使用该软件的学术机构中部署。Cilia.AI模型在多种细胞和脑切片的非训练数据集上表现稳健，但性能仍依赖于染色质量和信噪比，需专家监督。与现有工具（如CiliaQ）相比，Cilia SubQ在亚结构域分析方面提供了独特优势，同时支持3D检测的可行性。SubQ_BB_DC流水线适用于分离良好的中心粒，对于紧密并置的中心粒（RPE-1细胞）需改用Centrin-2等核心标记。SubQ_TZ和SubQ_CT流水线通过多层次严格过滤滤除非纤毛噪声，并可灵活适配其他标记。研究人员强调手动校正策略：可针对全纤毛或仅针对特定亚结构域进行干预。局限性包括：主要验证于单层细胞和脑切片，未扩展至其他组织或类器官；主要基于2D MIP图像，虽20%以内纤毛与成像平面夹角>30°（3D信息损失有限），但3D/4D应用仍需额外优化；动态图谱生成脚本未集成自动事件追踪。
研究结论（翻译原文“Discussion”末段及“Results”总结）：Cilia SubQ流水线适用于批量处理，提供高通量、可重复的初级纤毛及纤毛亚结构域定量分析，数据输出量更大且手动操作时间减少。该套件通过模块化设计，将纤毛检测、亚结构域分割、长度测量和运输动力学分析整合在统一框架中，为广泛的研究人员提供了灵活、高效且可追溯的分析工具，有助于加速纤毛生物学和纤毛病的机制研究。
