《Microchemical Journal》：Electrochemical immunosensor for Busulfan in plasma based on a competitive assay: Validation with liquid chromatography–tandem mass spectrometry method
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Mohamed Zouari|Ahmet Cetinkaya|Sibel A. Ozkan•开发了一种基于磁珠的电化学免疫传感器，用于检测血浆中的白消安•这是首个用于直接定量生物样本中白消安的电化学免疫检测方法•检测灵敏度高，检出限为30?ng?mL?1，线性范围为100–200
Mohamed Zouari|Ahmet Cetinkaya|Sibel A. Ozkan
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开发了一种基于磁珠的电化学免疫传感器，用于检测血浆中的白消安
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这是首个用于直接定量生物样本中白消安的电化学免疫检测方法
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检测灵敏度高，检出限为30?ng?mL?1，线性范围为100–2000?ng?mL?1
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在添加了标准物质的血浆样本中测试，结果准确且精密度高（回收率为99–104%，相对标准偏差＜5%）
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通过统计分析（t检验和F检验）与LC–MS/MS检测结果高度一致
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检测速度快（约30分钟），操作简单，成本较低，适合用于分散式的药物浓度监测
引言
由于白消安本身的电活性较低，再加上生物样本的复杂性，对其在血浆中的分析是一项颇具挑战性的工作[1]。样本中存在大量内源性化合物，加之药物浓度通常较低，这些都给定量分析带来了困难，因此需要使用具有选择性且稳定性强的分析方法[2]。白消安是一种双功能烷化剂，常被用作造血干细胞移植前的预处理药物，这类药物可通过在骨髓微环境中创造空间来促进干细胞植入[3]。从分析角度而言，由于白消安的物理化学特性，包括其化学反应性以及缺乏可直接利用的电化学响应特征，因此研究其在血浆中的含量具有重要意义。这些特点促使人们开发出主要依赖分离技术的分析方法[1]。
在各类分析技术中，LC-MS/MS因其高灵敏度、高选择性和较强的分析稳定性，目前被视为首选方法[4]、[5]。然而，该技术需要昂贵的仪器、熟练的操作人员以及较为复杂的样品前处理流程，这可能限制其在常规分析或方法学研究中的应用[6]、[7]。为此，人们开始探索其他分析策略来补充色谱法。有研究报道，基于PVC膜的电位传感器可用于测定药物制剂中的白消安含量[8]。此外，还有研究探讨了白消安与双链DNA的相互作用，通过监测电活性指标的变化间接检测白消安造成的DNA损伤[9]。这些研究都表明电化学技术可用于研究与白消安相关的过程，但目前这些方法要么仅限于质量控制领域，要么仅用于机制研究，难以用于复杂生物样本中白消安的选择性定量分析。相比之下，电化学传感器具有仪器简单、响应迅速以及可微型化的优点[10]。但由于白消安本身的电活性较差，其在电化学分析中的应用仍受到限制。为克服这一难题，利用抗原-抗体反应的高特异性设计的免疫化学方法成为一种很有前景的解决方案[11]。对于白消安这类低分子量化合物，夹心型免疫分析法并不适用，因此需要采用竞争型免疫分析法[12]。将竞争型免疫识别与电化学信号转换相结合，即便对于没有电活性的分析物，也能将其特定的生物相互作用转化为可测量的分析信号[13]。
在本研究中，我们报道了一种基于磁珠的竞争型电化学免疫传感器的开发，该传感器可用于检测添加了标准物质的人血浆中的白消安。该传感器通过将白消安-牛血清白蛋白结合物固定在羧基功能化的磁珠上，再结合单克隆抗白消安IgG抗体，以竞争型模式工作，通过HRP标记的二次抗体产生信号，并借助安培检测技术进行检测。据我们所知，目前还不存在将竞争型免疫分析法与磁珠辅助安培检测相结合、用于直接定量血浆中白消安的电化学免疫传感器，这也凸显了所提出分析方法的创新性。
本研究的内容包括优化免疫分析的条件，评估该传感器在复杂生物样本中的分析性能，以及通过与参考用的LC–MS/MS方法进行比对来验证其准确性。所开发的传感器具有较高的灵敏度、良好的选择性和快速的响应速度（分析时间约为30分钟），因此适用于临床相关的浓度范围。通过添加标准物质的人血浆样本测试，证明了该传感器具备可靠的准确度和精密度。
鉴于白消安浓度监测在临床上的重要性，所提出的这种传感器为传统分析方法提供了一种简单、便携且成本较低的替代方案。总体而言，这项研究证明了电化学免疫检测技术可作为一种有潜力的辅助工具，用于在临床环境中快速、便捷地检测白消安浓度。
章节摘要
仪器与电极
色谱分析是使用超高效液相色谱系统配合三重四极质谱仪（TSQ Quantis，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）进行的，该质谱仪配备了电喷雾离子化源。超高效液相色谱系统还包括四元泵、自动进样器以及温度可控的色谱柱箱。数据采集与处理则通过TraceFinder? 4.0软件完成（TraceFinder，赛默飞世尔科技公司）。
方法性能
LC–MS/MS方法的性能是依据公认的生物分析方法学验证原则进行评估的，以此确定其是否适合作为与电化学免疫传感器对比的参考方法。总体而言，该方法在灵敏度、选择性和重复性方面均表现出可靠的性能。在研究的浓度范围内，分析物浓度与信号响应之间存在良好的线性关系，相关系数
结论
本研究成功开发了一种双重分析方法，用于检测人体血浆中的白消安，该方法结合了竞争型电化学免疫传感器与经过验证的LC–MS/MS方法。该免疫传感器基于磁珠辅助的竞争型免疫分析法，利用白消安-牛血清白蛋白结合物、单克隆抗白消安抗体以及HRP标记的二次抗体，再通过H?O?/对苯二酚氧化还原体系，在印刷碳电极上进行安培检测。所开发的
CRediT作者贡献说明
Mohamed Zouari：负责原文撰写——初稿撰写、资料收集、方法设计、实验实施、概念构思。Ahmet Cetinkaya：负责原文撰写——审阅与编辑、结果可视化、项目监督。Sibel A. Ozkan：负责原文撰写——审阅与编辑、方法验证。
利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
M.Z感谢突尼斯高等教育与科学研究部为支持该实验室的工作而提供的财政资助。
