《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：circFOXP1 Promotes Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Progression Through Regulating EREG/MAPK/ERK Axis
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环状RNA（circRNAs）对于触发胰腺导管腺癌（PDAC）进展具有不可或缺的作用。然而，circRNAs影响PDAC的特定生物学过程及其机制在很大程度上仍不清楚。该研究报道，circFOXP1是促进PDAC进展的关键因子，其在患者肿瘤组织中显著上调，并且与
环状RNA（circRNAs）对于触发胰腺导管腺癌（PDAC）进展具有不可或缺的作用。然而，circRNAs影响PDAC的特定生物学过程及其机制在很大程度上仍不清楚。该研究报道，circFOXP1是促进PDAC进展的关键因子，其在患者肿瘤组织中显著上调，并且与更晚的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期及较差预后相关。功能研究表明，敲低circFOXP1可在体外和体内显著抑制PDAC细胞增殖、迁移和侵袭。机制上，circFOXP1作为miR-320b的分子海绵（molecular sponge），导致表皮生长因子受体（EGFR）配体表调素（EREG）上调，并继而激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号通路；该通路对于维持PDAC的侵袭性表型至关重要。在体内，应用中和抗体阻断EREG可显著削弱circFOXP1诱导的肿瘤发生作用。上述发现强调了circFOXP1作为一种新型生物标志物的潜力，并提出其可作为改善PDAC患者生存的新型治疗靶点。
该论文发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，围绕胰腺导管腺癌（PDAC）中环状RNA（circRNA）的致癌机制展开，核心在于鉴定并阐明circFOXP1在PDAC进展中的功能及其分子通路。研究背景方面，PDAC是消化系统恶性程度极高的肿瘤之一，患者总体生存率长期偏低，主要原因包括起病隐匿、确诊时多已局部侵袭或远处转移，以及对化疗和新兴免疫治疗存在固有或获得性耐药。因此，寻找新的早期诊断标志物、预后指标和可干预的分子靶点，是PDAC研究中的重要任务。近年来，circRNA因其闭环结构稳定、不易被外切核酸酶降解，并可通过充当miRNA海绵、结合RNA结合蛋白、调控转录与翻译等方式参与肿瘤生物学过程，成为研究热点。然而，在PDAC中，circRNA如何调控关键致癌信号网络，尤其是表皮生长因子受体（EGFR）相关通路，仍缺乏充分认识。基于此，研究人员开展本研究，旨在解析circFOXP1是否参与PDAC恶性进展及其潜在机制。
研究人员首先通过circRNA芯片筛选PDAC差异表达circRNA，并在临床样本中进一步验证。结果显示，circFOXP1即hsa_circ_0001320在PDAC组织中显著高表达，且高表达与更晚的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期、更差的总体生存（OS）和无病生存（DFS）相关，提示其具有潜在预后标志物价值。随后，功能实验表明，circFOXP1能够促进PDAC细胞增殖、迁移、侵袭以及体内肿瘤生长和转移。机制研究进一步揭示，circFOXP1主要定位于细胞质，作为miR-320b的分子海绵解除其对表调素（EREG）的抑制，从而上调EREG并激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号轴，维持PDAC细胞的恶性表型。更进一步，在体内应用EREG中和抗体后，circFOXP1诱导的肿瘤促进作用被显著削弱，表明EREG是该致癌轴中的关键效应分子。总体而言，论文得出结论：circFOXP1是PDAC中的关键促癌circRNA，circFOXP1/miR-320b/EREG/MAPK轴构成了驱动PDAC进展的重要分子机制，具有生物标志物和治疗靶点双重意义。
在技术方法方面，研究人员主要采用了5对PDAC与癌旁组织的circRNA芯片筛选以及160例PDAC配对组织队列的qRT-PCR验证，结合RNase R消化、放线菌素D（Actinomycin D）处理、亚细胞分离和荧光原位杂交（FISH）鉴定circFOXP1的环状特征、稳定性及胞内定位；通过EdU、克隆形成、划痕、Transwell、流式细胞术等评价细胞表型；利用RNA pull-down、生物素标记miRNA捕获、双荧光素酶报告实验验证circFOXP1、miR-320b与EREG之间的相互作用；并通过RNA测序（RNA-seq）、KEGG富集分析、基因集富集分析（GSEA）、蛋白质印迹（Western blot）、皮下成瘤与尾静脉转移模型及EREG中和抗体干预完成机制与体内功能验证。
以下结合论文结果部分各小标题，对研究主体内容作系统解读。
3.1 The Identification of circFOXP1 in PDAC
研究人员首先通过5对PDAC组织与癌旁组织进行circRNA芯片分析，筛选到46个差异表达circRNA。结合TCGA数据库中母基因表达及预后信息，从候选分子中进一步在160例PDAC临床样本中进行qRT-PCR验证，最终确定hsa_circ_0001320，即circFOXP1，是在PDAC中稳定上调的关键circRNA。结构鉴定显示，circFOXP1来源于FOXP1基因第8至第12外显子的反向剪接，长度为692 nt，回剪接位点经Sanger测序确认。PCR、电泳、RNase R耐受性和Actinomycin D转录阻断实验共同证明其具备典型环状RNA特征且较线性FOXP1更稳定。亚细胞分离与FISH结果显示circFOXP1主要定位于细胞质，这为其后续作为miRNA海绵发挥功能提供了依据。
3.2 circFOXP1 Fuels the Proliferation, Migration and Invasion of PDAC Cells In
Vitro 在多种PDAC细胞系中，circFOXP1均较正常胰管上皮细胞hTERT-HPNE表达增高。研究人员采用针对回剪接位点的siRNA特异性敲低circFOXP1，或通过质粒进行过表达，并确认不影响线性FOXP1表达。EdU和克隆形成实验表明，敲低circFOXP1可显著抑制PDAC细胞增殖，而过表达则增强增殖能力。划痕实验和Transwell实验进一步显示，circFOXP1促进PDAC细胞迁移与侵袭。该部分结果说明circFOXP1在体外具有明确的促恶性表型作用。
3.3 circFOXP1 Accelerates Tumour Growth and Metastasis of PDAC In
Vivo 为验证体内功能，研究人员建立了裸鼠皮下成瘤模型和SCID小鼠尾静脉转移模型。结果显示，稳定敲低circFOXP1后，皮下肿瘤的体积和重量均明显下降，免疫组织化学（IHC）提示Ki-67阳性细胞比例减少，说明肿瘤增殖能力受抑。尾静脉转移模型中，circFOXP1敲低组肺部生物发光信号减弱，肺转移灶数量下降，H&E染色也证实转移负荷减轻。由此可见，circFOXP1不仅促进原位样肿瘤生长，也增强PDAC细胞在体内的转移潜能。
3.4 circFOXP1 Sponges miR-320b in PDAC Cells
鉴于circRNA常通过吸附miRNA发挥作用，研究人员用生物素标记circFOXP1探针进行RNA pull-down，结合数据库预测筛选潜在靶miRNA。结果发现，miR-320b是在不同PDAC细胞中均能被circFOXP1特异富集的候选miRNA。FISH显示二者在细胞质中共定位。进一步通过生物素标记miR-320b捕获实验和双荧光素酶报告实验，证实miR-320b与circFOXP1之间存在直接且特异的结合。该结果确立了circFOXP1作为miR-320b分子海绵的分子基础。
3.5 miR-320b Suppresses Proliferation, Migration and Invasion of PDAC Cells In
Vitro 研究人员随后单独考察miR-320b的生物学作用。qRT-PCR结果显示，miR-320b在PDAC细胞中低表达。功能实验表明，抑制miR-320b可促进细胞克隆形成、迁移与侵袭，而转染miR-320b模拟物则产生相反效果。由此证明miR-320b在PDAC中表现为肿瘤抑制性miRNA。这一发现与circFOXP1通过海绵吸附miR-320b发挥促癌作用的模型相一致。
3.6 circFOXP1 Upregulates EREG Expression to Activate the MAPK Pathway in PDAC
在明确circFOXP1/miR-320b互作后，研究人员进一步通过RNA-seq分析circFOXP1敲低后的下游转录变化，并与多个数据库预测的miR-320b靶基因求交集，获得6个候选分子。经qRT-PCR验证，EREG是唯一在两种细胞中均随circFOXP1敲低而下调的基因。进一步分析发现，EREG在PDAC组织中高表达，且与较差生存相关。序列分析表明，miR-320b可同时识别circFOXP1与EREG mRNA 3′非翻译区（3′ UTR）中的共同结合序列；双荧光素酶实验则证实miR-320b可直接靶向EREG 3′ UTR。机制层面，RNA-seq的KEGG与GSEA提示circFOXP1敲低后MAPK信号通路显著受抑。Western blot结果显示，miR-320b过表达或circFOXP1敲低均可降低EREG蛋白水平，并减少p38和ERK1/2的磷酸化，而不影响总p38和ERK1/2表达；miR-320b抑制则产生相反效应。救援实验进一步证明，miR-320b下调可部分恢复circFOXP1沉默所致的MAPK失活，而EREG敲低则能逆转circFOXP1过表达引起的p38和ERK1/2磷酸化增强。该部分结果完整建立了circFOXP1经miR-320b上调EREG并激活MAPK/ERK信号的机制链条。
3.7 circFOXP1 Sustains Malignant Phenotypes of PDAC via Modulating the miR-320b/EREG Axis
为验证上述信号轴对恶性表型的功能必要性，研究人员进行了系列救援实验。首先，在circFOXP1敲低背景下加入miR-320b抑制剂，可逆转PDAC细胞克隆形成、迁移和侵袭能力的下降，说明circFOXP1的促癌作用依赖于对miR-320b的拮抗。其次，在circFOXP1过表达细胞中敲低EREG，可部分消除MAPK信号激活，恢复细胞凋亡，并抑制circFOXP1引发的增殖增强。体内实验进一步显示，circFOXP1过表达促进皮下肿瘤生长，而应用EREG中和抗体后，肿瘤重量、体积以及Ki-67和EREG表达均明显下降。由此可见，EREG是circFOXP1致癌作用的重要执行分子，circFOXP1通过miR-320b/EREG轴维持PDAC恶性生物学行为。
3.8 circFOXP1 Overexpression Correlates With Poor Prognosis of PDAC Patients
临床相关性分析显示，circFOXP1表达水平与TNM分期正相关，提示其与疾病进展密切相关。Kaplan–Meier生存分析进一步表明，高circFOXP1表达患者的总体生存（OS）和无病生存（DFS）均更差。这些结果支持circFOXP1作为PDAC预后评估生物标志物的临床潜力，也从患者层面强化了其生物学重要性。
讨论部分围绕circFOXP1在PDAC中的新发现展开。研究人员指出，尽管circRNA已被认为是PDAC的重要调控因子，但其具体机制尚不完整。本研究首次在PDAC中系统证明circFOXP1异常高表达，且能通过海绵吸附miR-320b，上调EGFR配体EREG，进而激活MAPK/ERK通路，推动细胞增殖、侵袭和转移。论文还将这一发现与既往关于circFOXP1在膀胱癌、结直肠癌、骨肉瘤中的促癌作用联系起来，但强调其在PDAC中的表达特征和分子机制此前尚未见报道。对于miR-320b，研究人员结合既往文献和本研究结果，确认其在PDAC中具有抑癌作用，并在该工作中明确了其与EREG的直接靶向关系。对于EREG，论文则进一步补充了其在PDAC中的上游调控来源，说明circFOXP1是促使EREG升高并驱动EGFR相关MAPK信号激活的重要非编码RNA因子。整体上，讨论部分强调，circFOXP1/miR-320b/EREG/MAPK轴不仅拓展了PDAC分子发病机制的认识，也为EGFR相关靶向干预提供了新的分层思路与潜在切入点。
研究结论部分可译为：研究数据表明，circFOXP1是PDAC中的关键调控因子，其通过作为miR-320b的分子海绵异常激活EREG/MAPK信号，从而促进PDAC进展。circFOXP1有望作为PDAC治疗中的一种新型潜在生物标志物和治疗靶点。
