环状RNA circ_0003423通过吸附miR-330-5p上调TWIST1介导的软骨细胞炎症及细胞外基质降解促进骨关节炎进展

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Circular RNA circ_0003423 Promotes Osteoarthritis Progression by Sponging miR-330-5p to Upregulate TWIST1-Mediated Chondrocyte Inflammation and Extracellular Matrix Degradation

　　

摘要：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种以进行性关节软骨破坏、持续性炎症及功能障碍为特征的衰弱性退行性关节疾病。环状RNA（Circular RNAs, circRNAs）已成为OA发病机制中重要的表观遗传调控因子，然而circ_0003423在OA中的确切功能作用尚不清楚。本研究旨在阐明circ_0003423在OA进展中的表达模式、生物学功能及潜在分子机制。研究人员通过生物信息学分析GSE178724数据集以鉴定OA软骨中差异表达的circRNA。采用qRT-PCR定量检测IL-1β刺激软骨细胞中circ_0003423及miR-330-5p的表达水平；通过RNA pull-down及双荧光素酶报告基因实验验证circ_0003423与miR-330-5p、miR-330-5p与TWIST1的相互作用；Western blot检测TWIST1、I型胶原（Collagen I）、II型胶原（Collagen II）、ADAMTS5、MMP3、MMP13、总NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）的蛋白表达；CCK-8及EdU实验评估软骨细胞增殖，流式细胞术检测凋亡；ELISA测定促炎细胞因子水平；通过内侧半月板失稳（Destabilization of the Medial Meniscus, DMM）建立OA小鼠模型，关节腔内注射慢病毒shRNA敲低circ_0003423以验证体内 findings。结果显示，circ_0003423在OA软骨组织及IL-1β刺激的软骨细胞中显著上调。沉默circ_0003423可逆转IL-1β诱导的增殖抑制，减少凋亡，降低促炎细胞因子分泌，并减轻细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解。机制上，circ_0003423作为ceRNA直接吸附miR-330-5p，后者靶向TWIST1激活下游NF-κB信号通路，上调ADAMTS5、MMP3及MMP13，同时伴胶原下调。救援实验证实，抑制miR-330-5p或过表达TWIST1可抵消circ_0003423沉默的保护效应。体内实验中，circ_0003423敲低上调miR-330-5p，抑制TWIST1/NF-κB/MMP3/MMP13活化，减轻DMM小鼠软骨退变、软骨细胞凋亡及炎症反应。综上，circ_0003423通过作为ceRNA吸附miR-330-5p使TWIST1去抑制，激活下游NF-κB信号及MMP3/MMP13介导的ECM破坏，从而驱动OA进展。靶向circ_0003423是OA干预的潜在治疗策略。

论文解读：环状RNA circ_0003423通过吸附miR-330-5p上调TWIST1介导的软骨细胞炎症及细胞外基质降解促进骨关节炎进展

研究背景与意义

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是常见的退行性关节疾病，以关节软骨进行性破坏、慢性炎症及功能受损为特征，现有治疗仅能缓解症状而无法阻断病程。非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）尤其是环状RNA（circular RNA, circRNA）——具共价闭合环状结构、稳定性高的ncRNA——可通过microRNA（miRNA）海绵（ceRNA）机制调控基因表达，参与多种疾病进程，但circ_0003423在OA中的作用及机制不明。已有研究表明miR-330-5p在OA中下调并可靶向转录因子TWIST1（Twist Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor 1），而TWIST1异常高表达促进软骨炎症及细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解，circRNA是否通过ceRNA网络调控miR-330-5p/TWIST1轴驱动OA尚未阐明。该研究发表于Journal of Cellular and Molecular Medicine，旨在明确circ_0003423在OA中的表达、功能及circ_0003423/miR-330-5p/TWIST1/NF-κB调控轴的作用，为OA提供新治疗靶点。

主要技术方法

研究人员整合GEO数据集（GSE178724、GSE55235）进行生物信息学筛选；分离培养人软骨细胞并以10 ng/mL重组人IL-1β刺激建立体外OA模型，以内侧半月板失稳（Destabilization of the Medial Meniscus, DMM）术建立C57BL/6J小鼠体内OA模型；采用siRNA及慢病毒shRNA敲低circ_0003423，转染miR-330-5p mimic/inhibitor及TWIST1过表达载体行功能与救援实验；通过divergent/convergent引物PCR、RNase R消化及Sanger测序验证circRNA环状结构；qRT-PCR检测circ_0003423、miR-330-5p及mRNA表达；RNA pull-down（生物素标记探针）及RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）用抗Ago2抗体验证ceRNA复合物共定位；双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）验证circ_0003423与miR-330-5p、miR-330-5p与TWIST1 3′-UTR的直接结合；Western blot检测TWIST1、Collagen I、Collagen II、ADAMTS5、MMP3、MMP13、总NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65, Ser536）；CCK-8及EdU掺入实验检测细胞活力与增殖；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡；ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8分泌；小鼠膝关节组织行HE、Safranin O/Fast Green染色及TUNEL染色，按OARSI（Osteoarthritis Research Society International）评分系统评估软骨损伤；统计学采用t检验或单因素ANOVA及Kruskal-Wallis检验（OARSI评分），p<0.05为差异显著。

研究结果

3.1 Knockdown of Circ_0003423 Alleviates IL-1β-Induced Cell Viability Inhibition and Apoptosis in Chondrocytes

GSE178724数据集及qRT-PCR证实circ_0003423在OA软骨及IL-1β刺激软骨细胞中显著上调；经divergent引物PCR（cDNA有产物/gDNA无产物）、RNase R抗降解及back-splice junction Sanger测序验证其环状结构。siRNA有效敲低circ_0003423后，CCK-8及EdU实验显示恢复IL-1β抑制的细胞活力与增殖，流式细胞术显示凋亡率显著降低。结论：circ_0003423在炎症条件下病理性高表达，其沉默可挽救软骨细胞活力丧失并抑制凋亡。

3.2 Knockdown of circ_0003423 Alleviates IL-1β-Induced Inflammation and ECM Degradation in Chondrocytes

ELISA显示沉默circ_0003423显著降低IL-1β诱导的TNF-α、IL-6、IL-8上清浓度；Western blot显示逆转IL-1β引起的Collagen I与Collagen II下调及ADAMTS5上调。结论：沉默circ_0003423减轻炎症因子释放并维持ECM稳态。

3.3 circ_0003423 Directly Targets and Sponges miR-330-5p in Chondrocytes

circBase预测结合RNA pull-down显示miR-330-5p在circ_0003423探针组特异性富集；双荧光素酶报告基因显示miR-330-5p mimic抑制含野生型circ_0003423结合序列的报告载体活性而突变型无影响；Ago2 RIP证实circ_0003423与miR-330-5p共富集于RISC复合物；qRT-PCR示IL-1β下调miR-330-5p，circ_0003423敲低可部分恢复。结论：circ_0003423通过特异性结合位点直接吸附/隔离miR-330-5p。

3.4 miR-330-5p Directly Targets and Negatively Regulates TWIST1 in Chondrocytes

StarBase/miRDB/TargetScan联合GSE55235筛选得TWIST1为候选靶基因；miR-330-5p mimic显著降低TWIST1 mRNA及蛋白水平；双荧光素酶报告基因证实miR-330-5p与TWIST1 3′-UTR野生型结合抑制荧光素酶活性而突变型无影响；IL-1β上调TWIST1蛋白可被circ_0003423敲低抑制，该抑制被miR-330-5p inhibitor逆转。结论：miR-330-5p直接靶向TWIST1 3′-UTR负调控其表达。

3.5 The circ_0003423/miR-330-5p/TWIST1 Axis Regulates IL-1β-Induced Cell Death and ECM Changes in Chondrocytes

救援实验设Control、IL-1β、IL-1β+si-NC、IL-1β+si-circ_0003423、IL-1β+si-circ_0003423+miR-330-5p inhibitor、IL-1β+si-circ_0003423+TWIST1 overexpression六组。沉默circ_0003423恢复活力、增殖、抑制凋亡、降炎症因子、升Collagen I/II、降MMP3/MMP13/ADAMTS5及p-NF-κB p65；上述保护效应均被共转miR-330-5p inhibitor或TWIST1过表达所取消。结论：circ_0003423通过吸附miR-330-5p去抑制TWIST1，激活NF-κB信号及MMP介导ECM破坏驱动软骨细胞损伤。

3.6 Knockdown of circ_0003423 Alleviates Cartilage Injury in a Mouse Model of Osteoarthritis

DMM术后关节腔注射Lv-sh-circ_0003423，qRT-PCR示软骨中circ_0003423与TWIST1下调、miR-330-5p回升；HE及Safranin O染色示软骨结构破坏与蛋白聚糖丢失减轻，OARSI评分降低；TUNEL阳性细胞减少；组织ELISA示IL-6、TNF-α下降；Western blot示Collagen I/II上调，ADAMTS5、MMP3、MMP13及p-NF-κB p65下调。结论：体内沉默circ_0003423上调miR-330-5p、抑制TWIST1/NF-κB/MMP轴，减轻DMM小鼠OA进展。

讨论总结与结论翻译

讨论指出本研究首次阐明circ_0003423在OA软骨中高表达并通过ceRNA机制吸附miR-330-5p解除其对TWIST1的抑制，激活NF-κB信号及MMP3/MMP13/ADAMTS5介导ECM降解，体外沉默circ_0003423挽救软骨细胞表型、体内敲低减轻DMM模型软骨退变，确立circ_0003423/miR-330-5p/TWIST1/NF-κB轴为OA病理调控网络；研究局限性包括缺乏大样本临床验证、TWIST1下游全谱未完全解析、circ_0003423上调的上游机制（如力学负荷/表观遗传）未明及长期沉默安全性待评估。

结论（翻译）

综上所述，本研究表明circ_0003423在OA中病理性上调，并通过作为ceRNA吸附miR-330-5p使TWIST1去抑制，激活下游NF-κB信号及MMP介导的ECM破坏从而驱动OA进展。体外及体内结果均证实沉默circ_0003423可恢复软骨细胞活力、减轻凋亡与炎症并保护软骨完整性，确立了circ_0003423/miR-330-5p/TWIST1/NF-κB调控轴在OA发病机制中的生物学意义。circ_0003423是颇具前景的治疗靶点，后续需临床验证并开发关节靶向RNA递送策略以推动OA的circRNA靶向治疗应用。