《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Multi-Omics Landscape of Paraspinal Muscles in Spinal Muscular Atrophy With Scoliosis
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脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是一种由SMN1基因纯合缺失或突变引起的遗传性神经肌肉疾病，该缺陷导致生存运动神经元（survival motor neuron, SMN）蛋白水平降低，进而引起脊髓α-运动神经元进行性
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是一种由SMN1基因纯合缺失或突变引起的遗传性神经肌肉疾病，该缺陷导致生存运动神经元（survival motor neuron, SMN）蛋白水平降低，进而引起脊髓α-运动神经元进行性变性及后续躯干和四肢的对称性弛缓性瘫痪。大多数SMA患者在青少年晚期会发展为严重的脊柱侧凸。鉴于椎旁肌——特别是多裂肌——对维持脊柱稳定性具有不可替代的作用，其在SMA中的位点特异性多组学特征尚不明确。该研究对SMA患者和手术对照组的双侧多裂肌样本进行了整合多组学测序分析，鉴定出5219个差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）、1063个差异表达蛋白（differentially expressed protein, DEP）和370个差异代谢物（differential metabolite, DM），这些差异分子在葡萄糖和氨基酸代谢通路中显著富集，特别是糖酵解/糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）的关键步骤。糖酵解过程中的关键酶如PFKM、ENO3和PKM1显著下调。值得注意的是，SMA双侧椎旁肌的比较分析揭示了凹侧和凸侧在碳水化合物和氨基酸加工方面存在不对称的代谢特征。关键调控酶表现出显著的差异表达：PYGL是淀粉和蔗糖代谢的核心驱动酶；肌酸激酶参与精氨酸和脯氨酸代谢；PGAM2是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的关键介导因子。这些代谢特征表明多裂肌存在复杂的代谢重编程，其中不对称差异提示机械负荷的影响，而系统性失调则与SMN耗竭的效应相一致。
该研究发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，旨在通过整合多组学方法系统刻画SMA患者椎旁肌的分子特征。研究背景方面，SMA传统上被视为纯神经源性疾病，但Cifuentes-Diaz等人的研究表明，骨骼肌中SMN的选择性缺失可诱发原发性肌营养不良，而肌肉特异性SMN恢复则可缓解表型，这重新定义了SMA为一种多系统疾病。此外，肌内MRI显示SMA肌肉受累具有高度选择性模式，呈近端至远端梯度分布，且存在间室差异。除运动和呼吸功能障碍外，进行性脊柱侧凸是SMA的主要并发症之一，2型患者手术率高达84%，3a型为40%。多裂肌作为核心深层椎旁肌，为脊柱提供节段稳定性，但在SMA相关脊柱侧凸中，双侧多裂肌是否存在不对称的多组学扰动尚不清楚。
研究人员纳入了2021年5月至2023年4月期间北京协和医院收治的SMA患者及因腰椎疾病（无脊柱畸形）接受手术的对照个体。SMA组纳入标准包括：经基因检测确诊、接受初次后路脊柱内固定手术、手术年龄小于30岁；对照组纳入标准包括：患有无脊柱畸形的腰椎疾病、手术年龄小于30岁、症状持续时间小于6个月且术前1个月内无急性加重或糖皮质激素使用、术前MRI示Goutallier分级≤1。研究中，10例SMA患者和5例对照个体接受了多组学测序，另设独立队列用于免疫印迹验证。样本于术中获取，双侧多裂肌样本取自SMA患者主弯顶点及对照L5水平，每份样本分三份分别用于转录组学、DIA-MS蛋白质组学和非靶向LC-MS代谢组学分析。
在转录组学层面，SMA与对照组比较鉴定出5219个DEG，其中3221个上调、1998个下调。这些DEG在153个疾病本体（disease ontology, DO）术语中富集，包括营养性疾病、肥胖症等，其中有5个术语与肌肉疾病相关。基因本体（gene ontology, GO）分析显示，前10个生物学过程（biological process, BP）中有9个与肌肉相关，前10个细胞组分（cellular component, CC）中有9个为肌细胞结构区室，前3个分子功能（molecular function, MF）与肌肉相关。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析鉴定出56个显著富集通路，包括钙信号、cAMP、cGMP-PKG和AMPK信号通路。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析揭示前10个枢纽基因为CXCL13、BDKRB1、S1PR4、GPER、CXCL3、MCHR1、GALR3、SSTR5、OPRD1和ANXA1。
在双侧椎旁肌转录组比较中，SMA_A（凹侧）与SMA_T（凸侧）比较揭示573个DEG，其中133个在凹侧上调、440个在凸侧上调。DO富集显示与下呼吸道疾患、肺部疾患、阻塞性肺部疾患和动脉硬化相关。GO分析表明DEG富集于免疫和炎症相关有很多种研究、比等BP术语，以及NADPH氧化酶激活物活性等MF术语。KEGG通路分析证实骨舰船分化、吞噬体和衰老期舰胞外陷阱形成等通路富集。
蛋白质组学分析鉴定出SMA与对照组间1063个DEP，其中733个上调、330个下调。GO富集揭示这些DEP主要参与糖酵解过程、脂质转运和单生物体碳水化合物代谢过程等BP术语，以及肌钙蛋白复合物、肌球蛋白复合物等CC术语。KEGG分析显示DEP富集于磷酸戊酮酸途径、心肌收缩、糖酵解/糖异生和氨基酸生物合成等通路。PPI网络前10个枢纽蛋白为PPH、PSGAPDH、ENO3、PKM鼻血、PFKM、TKT、IDH2、MDH2、LDHA和ACLY。
双侧椎旁肌蛋白质组比较鉴定出133个DEP，其中41个在SMA_A上调、92个在SMA_T上调。这些DEP富集于嘌呤核苷酸代谢过程、糖酵解过程和细胞钙离子稳态等BP术语，以及线粒体内膜、线粒体呼吸链复合物I等CC术语。KEGG分析揭示糖酵解/糖异生、脂肪细胞脂解调控、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢和酪氨酸代谢等通路富集。PPI网络前10个枢纽蛋白为PPH、tPFKL、PGAM2、HSPA2、PYGL、CKM、tALDOA、FBP2、tHSPH1和ALDH1L1。
代谢组学分析鉴定出SMA与对照组间370个DM，其中179个上调、191个下调。SMA肌肉中儿茶素、脱氧胞苷和α-酮戊二酸升高，而肌苷-5'-单磷酸、鸟苷单磷酸和α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸降低。KEGG通路富集突出显示丁酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转化、组氨酸和烟酸与烟酰胺代谢等全局代谢转变，同时脂肪酸生物合成和甘油磷脂代谢也发生显著改变。
双侧椎旁肌代谢组比较鉴定出94个DM，其中17个在SMA_A上调、77个在SMA_T上调。SMA_A中胱氨酸、脯氨酸-羟脯氨酸和雄甾酮升高，而SMA_T中2-甲基戊二酸、棕榈酰肉碱、肌肽和肌苷更高。KEGG分析突出这些DM主要参与组氨酸、淀粉和蔗糖以及β-丙氨酸代谢。
整合多组学分析方面，SMA与对照组比较鉴定出37个KEGG通路同时在转录组、蛋白质组和代谢组水平失调，其中10个通路与碳水化合物代谢相关，7个涉及氨基酸代谢。互补的交互式通路浏览器（Interactive Pathways Explorer, iPath）分析进一步证实在碳水化合物和氨基酸代谢中的系统性代谢紊乱。在糖酵解/糖异生通路中，鉴定出29个DEP、31个DEG和1个DM区分SMA与对照。关键的是，PPI网络分析将PFKM、PKM和ENO3确定为前10个枢纽蛋白，MDH2同样被鉴定为介导半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的枢纽蛋白。这四种代谢枢纽在独立队列中通过免疫印迹验证。
双侧椎旁肌不对称的整合多组学分析鉴定出9个同时富集DEG、DEP和DM的KEGG通路，这些通路主要汇聚于氨基酸代谢（如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸）和能量代谢（如淀粉和蔗糖通路）。PPI网络分析进一步确定三个前10枢纽蛋白为这些代谢转变的关键介导者：PYGL（淀粉/蔗糖通路中唯一的DEP）、CK（参与精氨酸和脯氨酸代谢）以及PGAM2（调节甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）。这些枢纽在5例SMA患者的独立队列中通过免疫印迹验证，确认了不对称代谢失调。
讨论部分，研究人员指出SMA患者表现双侧对称性肢体无力伴近端优势，而本研究转录组分析显示SMA与对照多裂肌间DEG富集于肥胖、高脂血症和脂肪细胞脂解相关性术语。蛋白质组学揭示DEP参与脂质转运、胆固醇代谢和PPAR信号——脂肪细胞分化和脂质稳态的关键调节因子。代谢组学鉴定出脂肪酸和胆固醇代谢的DM。整合多组学一致证明SMA椎旁肌中脂肪细胞脂解和胆固醇代谢失调，表明脂质转运、代谢和降解以及脂肪细胞分化受损。值得注意的是，尽管整合分析未显示脂质代谢相关通路富集，但转录组分析揭示了双侧椎旁肌间脂肪细胞脂解调控和脂质-动脉粥样硬化通路的非对称富集，蛋白质组学确认了脂肪细胞脂解调控、脂肪消化和脂肪酶活性的DEP富集，代谢组学变化集中于脂肪酸代谢和降解，与转录组非对称性一致。这些数据共同证明SMA双侧椎旁肌存在脂质代谢失调的非对称性。
研究人员进一步指出，肌肉无力是运动神经元丢失和肌肉失神经支配前的早期事件，SMN在肌发生和肌肉功能中发挥关键作用，超越其在运动神经元中的作用。本研究中DEG富集于肌肉发育、肌源性分化和肌肉结构/功能等GO术语，以及肥厚型心肌病和心肌细胞肾上腺素能信号等KEGG通路，DEP同样富集于肌球蛋白/肌钙蛋白复合物术语和心肌病相关通路，提示SMA骨骼肌存在萎缩和肥大的混合表型。除上述通路外，DEG还富集于能量代谢相关通路和钙信号通路。PPI网络多个枢纽基因如GPER、MCHR1和OPRD1通过调节腺苷酸环化酶活性调控cAMP信号通路，同时参与钙离子转运。DEP富集于葡萄糖代谢、钙离子结合和转运相关GO术语和KEGG通路。PPI网络前10个枢纽蛋白均为碳水化合物代谢关键调节因子，包括糖酵解、磷酸戊糖途径和柠檬酸循环。代谢组学进一步鉴定出富集于糖酵解/糖异生和磷酸戊糖途径等能量代谢通路的DM。整合多组学分析证实了SMA患者椎旁肌中能量代谢的紊乱。
研究人员还发现，多组学分析揭示了SMA患者椎旁肌中多种氨基酸生物合成和代谢的异常，其中大多数氨基酸对骨骼肌结构、功能和发育至关重要。例如，甘氨酸促进这几种细胞增殖和肌肉质量同时减少肌肉 wasting；精氨酸通过增加胞质钙水平增强肌源性分化和肌管形成；半胱氨酸和甲硫氨酸通过谷胱甘肽合成调节肌肉分化；苯丙氨酸也促进肌源性分化。碳水化合物和氨基酸代谢可能在SMA中协同作用，因为几个枢纽蛋白同时参与两类代谢。TKT、IDH2和糖酵解酶包括PFKM、PKM和ENO3参与氨基酸生物合成，而MDH2和LDHA参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢。值得注意的是，枢纽基因和蛋白是基于网络连接性而非已建立的因果关系证据选择的，其在SMA骨骼肌中的致病作用有待进一步实验验证。
研究人员深入分析了脊柱侧凸与椎旁肌不对称的关系。在SMA中，源于神经源性萎缩的椎旁肌无力被认为是脊柱畸形的核心驱动因素，而脊柱侧凸的进展反过来又进一步加剧肌肉不对称。凹侧和凸侧DEG的GO和KEGG分析表明SMA患者双侧椎旁肌存在不对称免疫激活，PPI网络前10个枢纽基因中有7个参与免疫和炎症反应。值得注意的是，批量RNA-seq对免疫和炎症通路的差异富集可能反映双侧椎旁肌中免疫细胞的不对称浸润，而非肌细胞中的差异基因表达。DEG在双侧椎旁肌中还富集于钙信号通路，8个枢纽基因与钙离子转运相关。DEP在双侧椎旁肌中同样显示细胞钙离子稳态的差异富集。此外，SMA双侧椎旁肌DEP还富集于糖酵解过程的GO术语和糖酵解/糖异生的KEGG通路。关键枢纽蛋白如PGAM2通过促进成肌细胞融合支持肌肉生长；ALDOA对肌肉完整性至关重要，其缺失导致横纹肌溶解。整合多组学分析揭示了SMA患者双侧椎旁肌氨基酸生物合成和代谢的非对称性，其中精氨酸和脯氨酸代谢（由CKM调节）对骨骼肌健康和再生至关重要，非蛋白源性氨基酸β-丙氨酸是骨骼肌中肌肽合成的主要前体，而肌肽通过增强钙敏感性和收缩性维持肌肉稳态。研究人员假设双侧椎旁肌中氨基酸代谢的不对称性可能促进SMA相关脊柱侧凸的进展。
研究人员还将SMA与肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）和杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）进行了比较。ALS骨骼肌转录组分析揭示失调基因富集于肌肉发育、成肌细胞分化和线粒体结构，糖酵解和糖异生紊乱；蛋白质组水平同样显示肌肉发育、收缩和代谢过程的失调；ALS murine肌细胞的分泌代谢组也显示精氨酸生物合成和烟酸代谢等通路的富集。DMD骨骼肌中失调基因主要富集于免疫应答和肌肉再生，蛋白质组学显示DMD肌肉中糖酵解/糖异生、柠檬酸循环和氨基酸代谢相关蛋白的失调。值得注意的是，DMD中相当部分失调的代谢蛋白与SMA趋势相同，表明DMD和SMA之间存在相似的代谢紊乱。因此，SMA骨骼肌表现为一种混合表型，兼具神经源性疾患和原发性肌病的特征。
该研究存在若干局限性。首先，多组学数据的高维度性质与有限样本量相比，存在固有的统计不稳定性和假阳性风险。在该发现驱动的罕见病队列中，跨比较的标准多重检验校正可能过于保守，特别是对于配对SMA样本，导致高假阴性率而湮没细微病理信号。为平衡统计效力和假阳性控制，研究人员采用了多层策略——利用原始p值进行发现，同时强制执行严格的跨组学趋同、PPI枢纽 constraints和独立免疫印迹验证。其次，有限的队列和异质性SMA表型排除了多组学改变与SMN2拷贝数、临床亚型或脊柱畸形严重程度的确定性相关。另一局限性是组织采样时缺乏同步影像学评估。研究人员利用部分患者现有的外部MRI记录以减少冗余成像，但鉴于SMA的进行性，这些历史扫描可能无法代表手术时肌肉的代谢状态，这种时间差异阻止了确定的临床影像学相关。需要更大的患者队列来将多组学数据与SMA亚型、椎旁肌影像学和脊柱侧凸严重程度等临床因素相关联。
研究结论：SMA与椎旁肌中异常的碳水化合物和氨基酸代谢相关。此外，这些患者椎旁肌凹侧和凸侧之间存在显著的代谢不对称性。这些代谢紊乱可能由SMN缺乏和脊柱畸形的生物力学应激共同塑造。
