Margalefidinium polykrikoides 组Ⅲ生活史的再审视

《Journal of Phycology》：Revisiting the life cycle of Margalefidinium polykrikoides Group III

　　

甲藻（Dinoflagellates）产生包囊以抵御环境胁迫，其中营养耗竭通常被认为是诱导包囊产生的关键触发因子。休眠包囊（Resting cysts）具有厚壁，通常由一至多层构成，并经历较长的休眠期；与之相对，薄壁包囊（Pellicle cysts）具有单层薄壁，不经历休眠期或休眠期显著短于同种藻类的休眠包囊。Margalefidinium polykrikoides能够产生薄壁包囊和休眠包囊，而其近缘种M. fulvescens则已被报道产生南瓜状结构。本研究利用相差显微镜、延时显微摄影、流式成像颗粒分析系统（FlowCam）以及衰减全反射傅里叶变换红外显微光谱（ATR μ-FTIR），系统研究了M. polykrikoides美洲/马来西亚核糖型（组Ⅲ）品系囊状结构的产生环境触发因子、其在生活史中的功能以及囊状结构的化学组成。本研究观察到的囊状结构与此前在M. polykrikoides组Ⅲ NY品系和组Ⅰ韩国品系中描述的典型薄壁包囊存在差异，但与M. fulvescens的南瓜状结构无法区分。研究发现磷酸盐（P）耗竭是诱导囊状结构产生的主要环境因子；囊状结构可通过有性和无性两种途径形成。研究人员还报道了囊转运体（sac transporters）的存在——这是一种二倍体细胞，能够协助囊状结构的移动。ATR μ-FTIR分析结果表明，囊状结构主要由硫酸化多糖（Sulfated polysaccharides）构成，与M. polykrikoides日本品系以及Gymnodinium sp.产生的胞外聚合物（EPS）具有高度相似性。基于其单层薄壁及缺乏休眠期的特征，这些囊状结构被界定为薄壁包囊。

本研究聚焦于有害赤潮甲藻Margalefidinium polykrikoides组Ⅲ的生活史特征，相关成果发表于《Journal of Phycology》。M. polykrikoides是一种在全球多个沿海水域引发有害赤潮（HAB）的物种，对鱼类、贝类及桡足类具有危害性，其系统发育可分为四个组别，其中组Ⅲ主要分布于切萨皮克湾中下游及大西洋沿岸。甲藻通常通过形成包囊来应对不利生长条件，包括薄壁包囊和休眠包囊两种类型，前者为单层薄壁且不经历休眠，后者则为多层厚壁并经历休眠期。环境因素尤其是营养盐状况被认为是诱导包囊形成的关键， but the specific triggers and mechanisms remain incompletely understood, particularly for different strains and groups within species. Previous studies on M. polykrikoides Group III NY strain revealed the formation of both pellicle and resting cysts, while Group I Korean strains produced only asexual pellicle cysts in response to darkness. During preliminary experiments with M. polykrikoides Group III VA strain, researchers observed colorless sac-shaped structures that resembled pumpkin-like structures reported in M. fulvescens, but the triggers and functions of these structures were unknown. The current study was designed to elucidate the role of these sacs in the life cycle, assess nutrient effects on their formation, and determine their chemical composition.

研究人员采用非无菌培养的M. polykrikoides组Ⅲ VA品系，该品系分离自Lafayette River。营养实验设置了缺氮（-N）、缺磷（-P）、缺氮磷（-N-P）及营养充足（L1）四种处理，在20°C条件下培养7周，每周通过相差显微镜计数囊状结构数量。生活史时序分析则在28°C、14:10光暗周期、盐度25条件下，每3天取样，利用FlowCam和相差显微镜联合计数各类细胞形态，包括营养细胞、配子、二细胞链、四细胞链、合子（Planozygotes）、囊状结构及囊转运体。延时显微摄影记录了完整的囊形成与脱囊过程。化学组成分析采用ATR μ-FTIR对单个分离的囊进行红外光谱测定，并与已发表的多种硫酸化多糖标准谱图进行比对。

研究结果显示：囊状结构呈无色透明，具纵向条纹，形态似南瓜、洋葱或胡桃南瓜，一端具圆形塞状结构（plug），长度平均70.41±9.75 μm，宽度平均39.54±10.73 μm。营养实验表明，缺磷处理诱导了最高的囊产量，显著高于缺氮处理（p=0.0328）。生活史时序分析显示，培养初期以二细胞链和四细胞链为主，约6天后转变为单细胞；单细胞平均长度在前6天逐渐减小至约35.5 μm，此后趋于稳定，此变化被视为配子形成的信号。配子出现"舞蹈"行为并融合形成合子，合子呈钟形、具两条纵鞭毛，但未能发育为休眠包囊，而是体积缩小后游离或保持体积不变后游离。囊状结构于配子出现后形成，完整的囊形成过程仅观察到一次：异常形态的细胞被囊包裹，囊逐渐扩展，细胞变圆，最终通过无塞一侧脱囊。部分细胞内含有红体和黄体，这些细胞器在脱囊前被释放。部分囊内细胞发生裂解，空囊持续积累。研究首次报道了囊转运体——这是一种方形、具顶角和双反顶角、呈黄褐色、具两条纵鞭毛的二倍体运动细胞，通过一条纵鞭毛附着于囊并拖动其移动；囊转运体内部观察到单个具有单纵鞭毛的单细胞运动，也曾观察到囊转运体在静止囊内游动。休眠包囊在本研究中未观察到；虽偶见圆形、具颗粒和红体、无鞭毛的细胞，但其缺乏休眠包囊特征性的褐色、内生孢子和突起结构，故不视为真正的休眠包胞。ATR μ-FTIR分析显示6个独立囊的光谱一致，主要吸收峰对应糖环结构（1180–970 cm^-1）、硫键（1245–1220和840–820 cm^-1）及硫酸酯（1745–1710 cm^-1），表明囊主要由硫酸化多糖组成，与M. polykrikoides日本品系胞外聚合物A1和A2以及Gymnodinium sp.的胞外聚合物高度相似，但与Heterocapsa sp.的胞外聚合物存在明显差异。

讨论部分中，研究人员将本研究的囊状结构与M. fulvescens的南瓜状结构进行了比较，确认二者在形态特征上高度一致，包括条纹、开口、单细胞和双细胞链的包裹与逃逸行为，但本研究额外发现了有性生殖过程和囊转运体的存在，且未观察到四细胞链在囊内的情形。与M. polykrikoides其他品系的薄壁包囊相比，本研究囊状结构具有条纹、塞状结构、囊内单细胞、无鞭毛圆形细胞、囊转运体、囊的可运输性、显著扩展能力等独特特征，但同样具有包裹细胞、红体存在以及无色壁等共性。研究人员认为，本研究未能产生休眠包囊可能是品系特性所致，因为此前研究中部分品系同样未能成功诱导休眠包囊形成；氮磷可用性可能并非M. polykrikoides休眠包囊形成的关键因素。

对于囊转运体，研究强调这是甲藻中首次报道此类结构。其具两条纵鞭毛提示为二倍体，但形态均为方形而非合子的圆形，且具顶角结构，出现时间仅限于囊形成期而非合子形成的前后。其起源可能涉及配子融合，亦或是从休眠包囊萌发而来的裂殖细胞（Planomeiocytes），尽管本研究未观察到休眠包囊。囊转运体通过纵鞭毛附着并拖动囊的行为，与Prorocentrum cf. balticum拖动黏液陷阱的行为类似。

化学组成分析表明，囊的主要成分为硫酸化多糖，与多种甲藻的胞外聚合物具有结构相似性，包括日本品系M. polykrikoides的A1和A2组分（含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸及7%–8%硫酸基团），以及Gymnodinium sp.的硫酸化多糖。这些胞外聚合物此前已被证明具有抗病毒活性，并可能参与赤潮的鱼类毒性效应。与Heterocapsa sp.胞外聚合物的差异可能源于后者样品中的无机盐污染。与褐藻糖胶（Fucoidan）的相似性虽提示可能的结构特征，但由于M. polykrikoides胞外聚合物中未检测到岩藻糖，故该可能性较低。

生态意义方面，磷耗竭作为主要触发因子与Lingulaulax polyedra和Scrippsiella acuminata等物种中磷驱动休眠包囊形成的报道一致。有性生殖过程中配子"舞蹈"、融合及合子形成均符合已知甲藻特征，但本研究中合子最终未形成休眠包囊，推测可能通过分裂返回营养生长状态，这从合子体积缩小及末期二细胞链浓度增加得到间接支持。薄壁包囊可通过有性和无性两种方式形成，无性途径更为节能但缺乏遗传重组优势。研究人员推测囊可能具有躲避摄食的功能，建议对切萨皮克湾主要摄食者进行验证性实验。此外，观察到部分无运动能力的圆形细胞发生裂解，其特征与病毒感染的Heterocapsa circularisquama细胞相似，提示病毒感染可能是导致此类细胞形成和裂解的原因之一，但因其全部裂解故认为对生活史完成不重要。

研究结论指出：本研究首次报道了M. polykrikoides组Ⅲ VA品系中存在的囊状薄壁包囊，该结构与组Ⅲ NY品系的薄壁包囊形态不同，而与M. fulvescens的南瓜状结构相似。囊状薄壁包囊可通过有性和无性途径形成，磷酸盐耗竭是其主要诱导因子。尽管配子融合和合子形成过程与NY品系相似，但合子未能发育为休眠包囊。研究报道了新发现的二倍体生活史阶段——囊转运体，其通过附着和拖动囊实现运动功能，起源可能涉及配子融合，若此假设得到证实可被归类为具有特殊形态和行为的合子。ATR μ-FTIR数据表明囊状薄壁包囊主要由硫酸化多糖组成，与M. polykrikoides日本品系及Gymnodinium sp.的胞外聚合物具有高度光谱相似性。