《Journal of Peptide Science》：Edge-Grafted Polyarginine Functionalization of Graphene Nanocarriers Maintains Noncovalent Aromatic Drug Loading
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研究人员提出了一种正交功能化策略，其中肽（细胞穿透肽，CPP）接枝选择性地发生在带有羧酸基团的石墨烯纳米颗粒（B60）边缘，而π-共轭货物则吸附在基面上。聚精氨酸-11（R11）被共价固定，从而保留了用于π-π相互作用的芳香表面。使用1-芘甲酸（PyCA）和化
研究人员提出了一种正交功能化策略，其中肽（细胞穿透肽，CPP）接枝选择性地发生在带有羧酸基团的石墨烯纳米颗粒（B60）边缘，而π-共轭货物则吸附在基面上。聚精氨酸-11（R11）被共价固定，从而保留了用于π-π相互作用的芳香表面。使用1-芘甲酸（PyCA）和化合物8（一种π-共轭的NEK6抑制剂）表明，R11接枝不影响负载容量或热诱导释放。光谱和显微分析证实，功能化后基面保持完整且可及。分子动力学（MD）模拟表明，肽链在纳米颗粒外围形成柔性带电冠层，而不干扰分子-石墨烯相互作用。总体而言，边缘接枝的R11保留了π-π介导的负载，并支持设计用于递送难溶性芳香生物活性化合物的肽-石墨烯杂化系统。
**基于边缘功能化策略的肽-石墨烯杂化纳米载体构建及其对芳香药物负载与释放的影响**
**研究背景与意义**
纳米材料与肽的整合使得能够设计将可调控的生物特异性与明确物理化学性质相结合的杂化系统。在纳米医学中，肽主要可通过两种方式利用：作为自组装成纳米结构材料的构建模块，或作为功能部分修饰预形成的纳米材料，从而赋予靶向能力、抗菌特性并改善细胞摄取。细胞穿透肽（CPP）在此背景下尤其有价值，其中寡聚精氨酸序列相较于基于赖氨酸、鸟氨酸或组氨酸的其他阳离子肽表现出特别高的内化效率，而聚精氨酸-11（R11）因其约11个残基的最优链长成为最有效的支架之一。同时，石墨烯基纳米材料（GBNs）因其大的比表面积和扩展的芳香域，能够通过π-π相互作用高效负载芳香/π-共轭治疗剂，其氧化衍生物暴露的含氧基团（主要位于片层边缘和缺陷位点）允许共价功能化，而剩余的芳香基面仍可用于非共价吸附。R11富含胍基的阳离子结构恰好补充石墨烯边缘的化学性质，无需修饰芳香基面，这种组合耦合了两种互补功能：石墨烯表面可作为芳香/π-共轭分子的负载平台，而肽组分可改善与生物膜的相互作用并促进摄取。然而，大多数已报道的基于石墨烯的药物递送系统依赖于氧化石墨烯或其相关氧化衍生物，其异质结构和表面化学难以控制且重现性有限，且边缘结合的肽可能潜在地干扰基面药物吸附。因此，本研究旨在探究R11修饰的B60作为NEK6抑制剂载体的可行性，特别关注肽装饰是否干扰药物负载。NEK6是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与纺锤体组装和染色体稳定性，并与癌症进展和耐药性相关。化合物8是一种有前景的NEK6抑制剂先导化合物，但其水溶性差限制了其制剂和应用。此前研究已证明化合物8可通过π-π相互作用有效负载于裸B60上。引入R11旨在增加互补功能，但也可能引入肽-药物竞争相互作用或改变石墨烯分散体的胶体行为。因此，本研究在《Journal of Peptide Science》上发表了相关成果，系统评估了边缘接枝R11功能化是否影响石墨烯平台对芳香药物的非共价负载与释放性能。
**关键技术方法**
本研究采用多学科技术方法构建并表征功能化纳米载体系统。首先，通过先前报道的环保方法制备了具有完整芳香基面、平均横向尺寸约120 nm、约六层石墨烯结构的B60纳米颗粒。利用固相肽合成法合成R11，并通过EDC/NHS介导的酰胺化反应，将R11共价接枝到B60边缘的天然羧基上，构建R11@B60平台。为研究负载，将模型分子1-芘甲酸（PyCA）和NEK6抑制剂化合物8分别通过超声分散与R11@B60在水中混合，形成非共价复合物PyCA@(R11@B60)和8@(R11@B60)，并通过多次洗涤循环去除未结合的分子。表征技术包括透射电子显微镜（TEM）分析形貌，紫外-可见吸收光谱和红外光谱分析负载与释放行为，以及分子动力学（MD）模拟研究分子与功能化表面的相互作用。MD模拟使用OPLS4力场和TIP3P水模型，在生理盐条件下进行300 ns的模拟，以分析化合物8在石墨烯基面上的吸附动力学以及R11肽链的影响。
**研究结果**
**3.1 模型组装体PyCA@(R11@B60)**
紫外-可见光谱显示，PyCA@(R11@B60)的光谱与使用未功能化B60形成的PyCA@B60组装体非常相似，均清晰显示出叠加在典型B60吸收带上的PyCA特征吸收峰，证实了超分子组装体的成功形成。多次洗涤循环后，PyCA吸收带强度在第一次洗涤后适度下降，随后谱图基本不变，表明游离PyCA被去除，而与石墨烯表面结合的PyCA分子保持关联。红外光谱进一步证实了组装体的形成，负载PyCA的光谱特征表明其以孤立物种形式吸附而非结晶态。荧光实验表明，加热PyCA@(R11@B60)分散体导致荧光强度显著增加，证实了PyCA在平台上的高效负载（此时荧光因π-π相互作用而猝灭）及其热触发释放。
**3.2 药物负载系统8@(R11@B60)**
化合物8在水介质中可在橙色形式（Form II，最大吸收约480 nm）和无色水合形式（Form I，最大吸收330 nm）之间可逆转换。紫外-可见光谱分析表明，8@(R11@B60)分散体的光谱行为与8@B60非常相似，其特征吸收带在第二次洗涤后基本不变。负载效率估计在约46%至92%之间。红外光谱清晰显示了吸附在平台上的化合物8的特征峰。尽管化合物8结构比PyCA更复杂、具有更大构象灵活性和多个极性基团，但与石墨烯表面的主导相互作用仍是π型，尽管存在可能建立竞争相互作用的肽残基。热释放实验显示，加热8@(R11@B60)分散体时，化合物8的Form II在约500 nm的特征吸收随时间逐渐降低，同时在330 nm处出现明确吸收带，表明释放的分子在水中转化为无色水合形式。与先前对8@B60的研究比较表明，R11接枝不干扰化合物8的热诱导释放。
**3.3 8@B60和8@(R11@B60)系统的动力学**
分子动力学模拟评估了肽功能化是否影响药物负载。对于8@B60系统，模拟显示化合物8在整个模拟过程中保持吸附并在石墨烯平面上自由移动，进行连续表面扩散，吸附距离通常在π-π堆积相互作用的典型范围（约3.3–3.6 ?）内。径向分布函数（RDF）分析显示在约4–5 ?处有一个显著的第一峰，表明配体优先近距离接触表面。对于8@(R11@B60)模型，尽管共价连接的聚精氨酸链引入了局部空间位阻和静电扰动，但并未抑制化合物8的吸附能力；配体仍保持与石墨烯平台的持续接触，尽管观察到其探索距表面更远距离构型的倾向性略有增加。定量比较表明，两个系统的吸附相关描述符高度可比：最常出现的吸附距离范围均为3–4 ?，平均吸附物-石墨烯距离相似。尽管在存在R11的情况下停留时间和吸附帧数略有减少，但差异相对较小。此外，对化合物8与R11精氨酸残基之间相互作用的分析表明，其相互作用比例极低，主要是由瞬态溶剂辅助介导的非特异性接触，而非持久稳定的结合模式。
**讨论与结论**
本研究证明，CPP R11的共价功能化可以与石墨烯基纳米载体中π-π驱动的负载有效结合，且不损害石墨烯表面的固有吸附特性。正交设计策略（肽接枝选择性发生在纳米颗粒边缘，而芳香基面仍可用于非共价相互作用）对于保持负载效率至关重要。使用模型化合物PyCA和蛋白激酶NEK6抑制剂（化合物8）获得的实验结果表明，R11功能化既不影响负载容量，也不影响热诱导释放。光谱和显微分析证实，肽共轭后石墨烯基面的结构完整性得以保持，同时肽链形成外围带电冠层，不干扰负责货物结合的π-π相互作用。分子动力学模拟一致表明，化合物8保持稳定吸附在石墨烯表面，同时保留横向迁移率，这表明了一种动态而持久的结合状态，即使在聚精氨酸部分存在下也得以保持。重要的是，吸附后化合物8的π-共轭形式的稳定凸显了石墨烯平台在调节难水溶性药物物理化学行为中的积极作用。在肽存在下仍保持高负载产率和可控释放曲线进一步支持了该系统的稳健性。总体而言，这些发现提供了明确证据，表明边缘选择性肽功能化与石墨烯纳米载体中的基面吸附完全兼容。该架构为开发结合药物负载和难溶性π-共轭生物活性分子（如NEK6抑制剂化合物8）可控释放的肽-石墨烯杂化系统提供了一个有前景的平台。未来研究将侧重于R11-化合物8平台在肿瘤学和神经退行性疾病模型中的生物学验证。更广泛地说，结果表明石墨烯边缘的肽功能化可以与芳香分子的π-π介导负载相结合，且两个过程之间无显著干扰，这一发现可能有助于开发包含替代肽序列和生物相关π-共轭化合物的相关石墨烯基递送系统。
