生物样品中蝶呤分析综述：从分布与理化性质到样品前处理结合联用分离技术

《Journal of Separation Science》：An Overview of Pterin Analysis in Biological Samples: From Occurrence and Properties to Sample Pretreatment Combined With Hyphenated Separation Techniques

蝶呤是蝶啶家族中一类结构多样且具有生物活性的化合物，在广泛生物体的色素形成、氧化还原代谢、光感知及细胞信号传导中发挥关键作用。由于其极性高、化学稳定性差，并且存在多种氧化状态，因此其在生物样品中的定量分析具有较高的分析学挑战性。本综述系统概述了蝶呤的分布、结构及理化性质，随后详细讨论了旨在确保化合物稳定性和分析准确性的样品制备策略。研究人员评估了化学氧化、光化学衍生化以及抗氧化稳定化等方法在不同生物基质中的应用效果。进一步综述了当前将分离与检测相结合的先进分析技术，包括毛细管电泳（CE）、气相色谱（GC）和液相色谱（LC）与荧光、紫外（UV）、电化学或质谱检测联用的方法。文章特别关注了液相色谱-质谱（LC–MS）技术的最新进展，包括串联质谱（LC–MS/MS）和高分辨率方法，例如高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱（HPLC–Q/TOF-MS）；这些技术显著提高了蝶呤分析的灵敏度、选择性和通量，尤其是在结合亲水相互作用液相色谱（HILIC）分离模式时表现突出。这些进展推动了蝶呤作为临床诊断和生理学研究生物标志物的应用增长，并强调了依据该类化合物特异性分析挑战而建立稳健、适配基质的分析方案的重要性。

该文发表于《Journal of Separation Science》，是一篇关于蝶呤（pterins）在生物样品中分析方法学的综述。文章围绕蝶呤的天然存在形式、结构与理化性质、样品前处理策略，以及分离检测技术的发展脉络进行了系统归纳，核心目标是为生物样品中蝶呤的准确测定提供方法学层面的整合性认识。研究背景在于，蝶呤属于蝶啶类（pteridines）化合物的重要分支，在细菌、植物、动物及其他生物中广泛存在，参与色素形成、氧化还原反应、光感知、细胞通讯及辅因子相关代谢等多种生理过程。尤其从医学与生理学角度看，尿液新蝶呤（neopterin, NEO）等蝶呤指标已被用于反映系统性炎症，并与肿瘤、感染及自身免疫性疾病等状态相关，因此蝶呤被视为具有临床诊断潜力的生物标志物。

然而，蝶呤分析长期面临一系列突出问题。首先，蝶呤具有较高极性，且不同取代基与不同氧化还原状态会显著影响其溶解性、保留行为、离子化效率和荧光响应。其次，蝶呤化学稳定性有限，尤其四氢蝶呤（tetrahydropterins）和二氢蝶呤（dihydropterins）易在氧气、光照或不适宜pH条件下发生自氧化或降解。再次，同一化合物可存在完全氧化态、二氢态和四氢态，不同氧化态在生物学功能和临床意义上并不等同，但其同时测定又十分困难。最后，不同生物基质如尿液、血浆、脑脊液（CSF）、干血点（DBS）、组织和动物体表材料等，基质复杂度差异较大，导致前处理和检测策略必须进行针对性优化。正因如此，开展一项系统梳理蝶呤分析全流程的综述研究，对于提升方法可比性、分析可靠性及后续临床转化具有重要意义。

文章首先从化学基础出发，总结了蝶呤的结构特点及其分析学后果。蝶呤具有2位氨基和4位酮基，存在酮-烯醇互变异构，但热力学上以酮式更稳定。其另一重要特征是可处于多种氧化还原状态，包括完全氧化态、二氢态和四氢态，其中完全氧化态最稳定，而四氢生物蝶呤（BH₄）等还原态在空气中容易被氧化为二氢生物蝶呤（BH₂）甚至其他产物。不同氧化态的荧光特性亦明显不同：氧化态蝶呤通常具有较强荧光，而还原态荧光较弱或缺失。这些性质决定了样品前处理究竟应采用“氧化后统一测定”还是“稳定原始氧化态直接测定”的策略，也直接影响检测器选择。

作者为开展综述所归纳的关键技术方法主要包括：样品前处理中的化学氧化、紫外（UV）光衍生化、抗氧化稳定化、蛋白沉淀、固相萃取（SPE）及针对不同基质的稀释/过滤方案；分离技术中的气相色谱（GC）、毛细管电泳（CE）、反相液相色谱（RPLC）和亲水相互作用液相色谱（HILIC）；检测技术中的紫外检测、荧光检测、激光诱导荧光（LIF）、电化学检测及质谱检测（LC–MS、LC–MS/MS、HPLC–Q/TOF-MS）。文中涉及的样本来源包括人尿液、血浆、血清、脑脊液、干血点、细胞样品、人乳、鼠脑及昆虫表皮等生物材料。

在样品前处理部分，文章的小标题为“3 Sample Pretreatment”。该部分指出，蝶呤分析的困难主要源于光敏感性、还原态易形成多样氧化产物，以及在生物流体中浓度低、溶解性有限等因素。围绕这一问题，研究人员总结了两类主路径：其一是将还原态氧化为较稳定的氧化态后再测定；其二是通过抗氧化剂稳定原始还原态后直接分析。文中指出，传统上更偏好测定完全氧化态，因为其稳定性更高，但氧化过程本身可能引入转化不完全、产物比例偏移等问题。

在“3 Sample Pretreatment”中，关于化学氧化方法，研究人员重点总结了碘/碘化物氧化法、KMnO₄氧化法和酸性MnO₂氧化法。碘/碘化物氧化法最常见，但其缺点在于不能区分BH₂与BIO，且BH₄氧化可能部分形成蝶呤（PT）而非完全形成生物蝶呤（BIO）。KMnO₄氧化显示氧化时间和氧化剂浓度会显著影响PT/肌酐（CREA）和NEO/BIO比值，提示临床判读需结合前处理条件。酸性MnO₂则被用于尿液中若干氧化态蝶呤的制备与分析。由此可见，不同氧化体系会改变最终检测到的蝶呤组成，前处理并非单纯技术步骤，而会影响结果解释。

同一部分还保留了对光化学衍生化和衍生反应策略的讨论。研究人员指出，UV光照可替代部分化学氧化，柱后光化学衍生系统可在同一样品中测定NEO、BIO、PT、BH₂及BH₄，较传统碘氧化法提供更丰富信息。另有研究通过苯甲酰氯对BH₄进行衍生化，再采用LC–MS/MS分析，从而改善稳定性和质谱灵敏度。这说明衍生化不仅用于增强检测信号，也可作为保护不稳定分析物的手段。

关于还原态稳定策略，文章指出二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇（DTE）及抗坏血酸（AA）被广泛用作抗氧化稳定剂。文献总结表明，BH₄在酸性条件下较稳定，而在较高pH下迅速氧化；AA可显著抑制BH₄自氧化；DTT对NH₂、BH₂等稳定具有积极作用。对于尿液样品，0.1% DTT在乙腈中可在72 h内基本稳定氧化态和二氢态蝶呤，但BH₄建议在24 h内完成分析。对于血浆样品，采血管中预加DTT且控制采血至离心时间，对BH₄和BIO_total的可靠测定至关重要。

针对不同生物基质，文章亦进行了归纳。“3 Sample Pretreatment”部分指出，尿液前处理相对简单，多采用稀释、离心和过滤，必要时通过SPE提高选择性，其中混合模式吸附剂DSC-MCAX表现较优。脑脊液（CSF）基质干扰较少，通常仅需稀释和过滤，但新鲜样品应加入DTT和DETAPAC并迅速在?80°C保存；若有血液污染需立即离心去除红细胞。干血点（DBS）方法被视为高苯丙氨酸血症（HPA）新生儿筛查中尿液检测的潜在替代方案，具有采集和保存便利的优势。血浆和血清则通常需要蛋白沉淀，乙腈沉淀优于三氯乙酸，因为酸沉淀可能造成某些蝶呤共沉淀与低估。组织、细胞、人乳和鼠脑等材料则多结合裂解、超声、去蛋白及抗氧化保护。对于昆虫表皮、皮肤和眼等动物材料，二甲基亚砜（DMSO）提取可避免强酸强碱条件导致的蝶呤分解，并尽可能保留其原始形态。

在“4 Separation and Detection Methods”部分，文章依次综述了GC、CE与LC。小标题“4.1 Gas Chromatography”指出，GC仅适用于挥发性和热稳定性较好的化合物，因此分析极性蝶呤时需要衍生化。GC–MS较LC-荧光或二极管阵列检测（DAD）灵敏，但样品制备更复杂、分析时间更长，因此更多用于结构确证而非常规临床分析。该结论表明，GC在蝶呤分析中地位相对辅助性。

小标题“4.2 Capillary Electrophoresis”显示，CE具有高分离效率、分析速度快、样品和溶剂消耗低等优点。研究人员总结，蝶呤分离对pH极其敏感，尤其尿液中NEO和6-HMP结构相近，分离窗口较窄。UV检测虽然可用于昆虫体表等相对高含量样品中多种蝶呤的鉴定，但对临床样品灵敏度不足。相比之下，激光诱导荧光（LIF）检测灵敏度可比传统UV高约3个数量级，适于尿液中痕量蝶呤分析；LED诱导荧光（LEDIF）成本较低，但灵敏度逊于LIF。作者据此指出，CE是有潜力的替代平台，但受电渗流波动及重复性限制，在复杂生物样品中的应用仍需更高性能检测器或与质谱联用。

小标题“4.3 Liquid Chromatography”表明，LC是目前最常用的蝶呤分析平台。反相液相色谱（RPLC）长期用于定量分析，但由于蝶呤极性高，往往需要高水相流动相、梯度洗脱或离子对试剂。相比之下，HILIC更适合极性蝶呤，可使用挥发性流动相，且与电喷雾离子化质谱（ESI-MS）兼容性更好。文中总结了不同固定相表现：某些极性键合相可在不加离子对试剂条件下实现CSF中BH₄、BH₂、BIO、NH₂和NEO分离；氨基相有助于BIO和NEO的6位、7位位置异构体分离；而两性离子型ZIC-HILIC通常对多种蝶啶/蝶呤表现出更强保留，是当前较具优势的选择。作者还指出，通过适度调整HILIC条件及梯度洗脱，可实现包括还原态在内的12种蝶呤同时分离，这对多指标同步检测具有重要价值。

关于检测方式，文章总结了紫外、荧光、电化学和质谱等技术。荧光检测仍然是LC分析蝶呤中最常见的方法，对氧化态蝶呤高度灵敏，但还原态蝶呤需经氧化或光化学转化后才能有效检测，因此其适用性受到限制。电化学检测可与荧光联用，用于研究BH₄及其代谢物氧化过程。更重要的是，质谱检测，尤其LC–MS/MS和高分辨率HPLC–Q/TOF-MS，显著增强了蝶呤分析的选择性、灵敏度和多重检测能力。文中列举了多项应用：在人尿中，ZIC-HILIC–MS/MS可在无需氧化预处理条件下同时分析12种氧化态、二氢态和四氢态蝶呤；在CSF中，采用稳定同位素内标的LC–MS/MS可快速测定BH₄、BH₂、NEO和SP；在DBS中，UHPLC-ESI-MS/MS可用于BIO和NEO的新生儿筛查；在细胞样品中，LC–MS/MS可在单次进样中同时直接定量BH₄、BH₂和BIO；在尿液与细胞样品中，HPLC–Q/TOF-MS兼具定量和高分辨识别能力，可用于更广范围的蝶呤谱分析。

研究结果综合显示，文章得出的核心判断是：蝶呤分析正从依赖氧化前处理和单一指标检测，逐步转向保留原生氧化态的直接测定与多组分并行分析。尤其是在“4 Separation and Detection Methods”后段，作者明确指出，尽管氧化前处理已被广泛开发，但其机制复杂、效率有限且受浓度影响，越来越难满足不同氧化态蝶呤独立生物学意义的研究需求。相较之下，基于HILIC的LC–MS/MS或高分辨率MS检测，可在更少基质干扰、更佳保留及更高ESI效率条件下，实现原生蝶呤更稳健的定量。这一发展趋势进一步支撑了“定量蝶呤组学”（quantitative pterinomics）的提出，即通过同时检测更大范围蝶呤衍生物，开展系统层面的蝶呤代谢网络分析。

讨论部分的要点在于，样品前处理、分离模式和检测器选择三者必须围绕分析目的进行协同设计。若目标是总量分析或传统临床判别指标，氧化法仍有现实价值；若目标是阐明不同氧化态的生理或病理作用，则应更重视还原态稳定和原生状态检测。作者强调，不同生物基质对方法适配性的要求差异显著，因此不存在适用于所有样品和所有蝶呤的单一“标准法”。与此同时，高分辨率和串联质谱的引入，不仅改善了同量异位或同量异构化合物的区分，也提高了复杂基质中定量的可靠性。整体上，方法学发展的方向是提高鲁棒性、减少前处理偏差、扩大可同时测定的目标物范围，并最终服务于蝶呤生物学功能与临床标志物价值的深入阐明。

研究结论部分可译为：总之，生物样品中蝶呤的分析涵盖多种方法，每种方法均针对所研究样品的类型与稳定性需求进行设计。自化学氧化到UV光照等替代策略的出现，使传统方法的局限得到逐步克服。加入稳定剂以及尤其是固相萃取等样品制备策略，对于提升蝶呤分析的可靠性与准确性已具有新的重要性。GC、CE和LC等多种分离与检测方法提供了具有不同灵敏度和选择性的多样化选择。四极杆串联质谱和HPLC–Q/TOF-MS等质谱技术，为不同形式蝶呤的准确鉴定与定量提供了更先进的可能性。结合生物基质选择等具体应用场景考虑，进一步凸显了这些方法满足多样研究需求的适应性。分析技术的持续优化与整合，将有助于更深入理解蝶呤生物学及其作为临床生物标志物的潜力。