泰国禁售粘菌素后零售肉中携带移动粘菌素耐药基因肠杆菌的流行情况及基因组特征

《Microbiology and Immunology》：Prevalence and Genomic Characterization of mcr-Positive Enterobacteriaceae in Retail Meat in Thailand Following the Colistin Ban

　　

本研究旨在调查泰国在全国范围内禁止在食用动物中预防性使用粘菌素后，零售肉中携带移动粘菌素耐药（MCR）基因肠杆菌的流行情况和特征。研究人员于2023年7月至9月期间从超市和露天市场共收集了152份肉类样品（103份鸡肉和49份猪肉）。使用多重聚合酶链式反应（PCR）筛查^mcr-1至^mcr-5基因。所有超市样品检测均为阴性，而在露天市场的鸡肉和猪肉样品中分别检出^mcr基因的阳性率为15.4% (6/39) 和13.3% (4/30)，鉴定出^mcr-1和/或^mcr-3。研究人员从PCR阳性样品中共分离出21株菌株（11株来自鸡肉，10株来自猪肉）。大肠杆菌是主要菌种（n = 19），其次是肺炎克雷伯菌（n = 2）。所有^mcr阳性菌株均表现出多重耐药性。研究人员对19株非克隆菌株进行了全基因组测序（WGS）。来自猪肉样品的一株肺炎克雷伯菌同时携带^mcr-1和^mcr-8基因，这是泰国动物领域首次报道这种组合。此外，在选定的菌株中还鉴定出了毒力相关基因，包括粘附因子、毒素和铁摄取系统。基于核心基因组单核苷酸多态性（cgSNP）的系统发育分析显示，这些分离株之间存在显著的基因组多样性，表明其与粘菌素禁令前报道的菌株存在关联。这些发现表明，来自露天市场的零售肉可能是泰国^mcr阳性细菌传播的重要途径，并突显了将系统性零售肉监测纳入国家抗菌素耐药性（AMR）监测计划的迫切需要。

本研究旨在评估泰国在全国范围禁止在食用动物中预防性使用粘菌素后，零售肉类中^mcr基因的流行情况，并对携带^mcr基因的细菌进行特征分析。研究背景在于，抗菌素耐药性（AMR）已成为全球性的健康威胁，其中革兰氏阴性菌如大肠杆菌和肺炎克雷伯菌因与高发病率和死亡率相关而备受关注。随着产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和耐碳青霉烯类细菌的全球快速传播，治疗选择严重受限，导致临床重新依赖多粘菌素类药物。粘菌素（多粘菌素E）因此重新成为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后手段抗生素。然而，质粒介导的移动粘菌素耐药（MCR）基因的发现从根本上改变了这一格局。这些基因可水平转移，加速了粘菌素耐药性的传播，削弱了其作为最后手段疗法的价值。尤其令人担忧的是，在食用动物和零售食品中分离的产ESBL细菌中，^mcr基因的共现日益增多，进一步限制了本已有限的治疗选择。泰国是全球主要的禽肉和猪肉生产及出口国，在食用动物（尤其是猪）中检测到^mcr基因引起了人们对肉类污染及随后通过食品供应传播给人类的担忧。为此，泰国政府于2017年在动物领域实施了全国性的粘菌素使用禁令。尽管有此政策干预，但其对零售肉中^mcr基因流行率的影响尚不清楚。泰国目前的监测工作主要侧重于“一体健康”框架下人类、动物和环境领域中选定细菌（如大肠杆菌和沙门氏菌）的表型耐药性，但对零售肉的研究有限。鉴于零售肉是动物储库与人类暴露之间的直接界面，它可能在^mcr基因的传播中扮演关键角色。

为开展本研究，研究人员运用了多个关键技术方法。研究于2023年7月至9月在泰国空巴吞府收集了152份零售肉类样本（103份鸡肉，49份猪肉），分别来自三个露天市场和五个超市。通过多重PCR对样本进行^mcr-1至^mcr-5基因的筛查。对PCR阳性样本，使用添加了粘菌素或粘菌素联合头孢噻肟的麦康凯琼脂进行细菌分离。通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析菌株的克隆关系。通过肉汤微量稀释法测定粘菌素最低抑菌浓度（MIC），并通过纸片扩散法进行抗菌药物敏感性测试，包括检测产ESBL表型。利用S1核酸酶PFGE结合Southern杂交确定^mcr基因的定位（染色体或质粒），并通过接合实验评估其转移能力。对19株代表性非克隆分离株进行了全基因组测序（WGS），并利用生物信息学工具进行基因组注释、多位点序列分型（MLST）、耐药基因、毒力基因和质粒复制子分析，以及基于核心基因组单核苷酸多态性（cgSNP）的系统发育分析。

**3.1 泰国零售肉中^mcr基因的出现与细菌分离**
在152份肉类样本中，10份样本（6.7%；6份鸡肉，4份猪肉）通过多重PCR检测出^mcr-1和/或^mcr-3阳性。所有阳性样本均来自露天市场，而超市样本均为阴性。单独^mcr-1基因在鸡肉和猪肉样本中的检出率分别为10.2%和3.3%。^mcr-1和^mcr-3共现的比例在鸡肉和猪肉样本中分别为5.1%和10.0%。通过两种选择性培养基共分离出21株^mcr阳性菌株（11株来自鸡肉，10株来自猪肉），其中19株为大肠杆菌，2株为肺炎克雷伯菌。

**3.2 ^mcr阳性分离株的克隆多样性**
对19株^mcr阳性大肠杆菌进行PFGE分析，共得到17种不同的脉冲型，显示出高度的克隆多样性。

**3.3 ^mcr阳性菌株的粘菌素耐药性、抗菌药物耐药谱及^bla基因**
所有^mcr阳性菌株均对粘菌素耐药，MIC值在8至16 μg/mL之间。所有菌株均表现出多重耐药（MDR）表型。在鸡肉分离株中，对氨苄西林、四环素、氯霉素、萘啶酸和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的耐药率较高。在猪肉分离株中，对氨苄西林、氯霉素、四环素、链霉素、庆大霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和卡那霉素的耐药率较高。值得注意的是，在部分菌株中检测到了磷霉素耐药。产ESBL表型在鸡肉和猪肉分离株中的比例分别为36.4%和40%。在产ESBL菌株中，^bla_CTX-M-1和^bla_TEM最为普遍。

**3.4 ^mcr基因的定位与可转移性**
Southern杂交显示，大多数菌株的^mcr-1基因位于大小不一的质粒上（约32–245 kb），少数位于染色体上。所有^mcr-3阳性菌株的该基因均位于质粒上（约70–120 kb）。接合实验表明，21株菌中有15株能够成功转移携带^mcr基因的质粒。值得注意的是，同时携带^mcr-1和^mcr-3的菌株在接合时只转移了^mcr-3基因。此外，部分同时携带^mcr-3和^bla_CTX-M-1基因的菌株，这两个基因位于同一质粒上并可共转移。

**3.5 ^mcr阳性菌株的遗传特征**
全基因组测序分析表明，所有^mcr-1序列与数据库中的^mcr-1.1相同，^mcr-3序列对应^mcr-3.5。一株肺炎克雷伯菌分离株同时携带^mcr-1和^mcr-8，这是首次在猪肉分离株中报道此基因组合。MLST分析显示大肠杆菌分离株具有高度的克隆多样性，共鉴定出16种不同的序列型（ST）。耐药基因分析证实了高度的多重耐药负担，β-内酰胺酶基因广泛分布，且检测到多种其他类别耐药基因。毒力基因分析显示粘附相关基因最为普遍。cgSNP系统发育分析显示了显著的基因组多样性，并且本研究中部分猪肉分离株与禁令前报道的猪分离株紧密聚类，表明尽管有禁令，^mcr阳性谱系在食物链中持续存在。

在讨论部分，研究人员指出，本研究揭示了不同零售市场类型肉类样本中^mcr基因流行率的明显差异。超市样本全部为阴性，而露天市场样本污染严重。露天市场可能作为粘菌素耐药性人畜共患传播的储库。猪肉样本中^mcr基因的检出尤其令人担忧，其流行率超过了泰国禁令前报告的水平，表明禁令后预期的下降在消费者层面尚未完全实现。^mcr-1和^mcr-3的共现（占分离株的28.6%）是一个重大的公共卫生问题，它扩大了耐药性的基因储库并增强了水平基因转移的潜力。所有分离株均表现出多重耐药和对粘菌素的表型耐药，反映了临床治疗选择的有限性。^mcr基因与ESBL决定簇的共现进一步加剧了这一问题，本研究中部分菌株的^mcr-3和^bla_CTX-M-1位于同一质粒上，表明即使没有直接的粘菌素压力，由β-内酰胺类药物使用驱动的共选择也可能有助于粘菌素耐药性的持续存在。此外，本研究首次报道了从泰国鸡肉中分离出产ESBL的^mcr-1阳性肺炎克雷伯菌，凸显了家禽作为多重耐药病原体潜在储库的可能性。^mcr基因的基因组背景为其传播动态提供了见解，质粒介导的^mcr基因占主导地位，且接合实验证实了高转移频率。一个特别值得注意的发现是鉴定出一株同时携带^mcr-1和^mcr-8的肺炎克雷伯菌，这是零售猪肉中该组合的首次报道。MLST和cgSNP分析揭示了高度的遗传多样性，并提供了^mcr阳性谱系跨时间持续存在的证据。某些序列型与禁令前动物和人类分离株的系统发育聚类表明，尽管有监管干预，某些谱系仍然持续存在。^mcr阳性分离株中毒力相关基因的检测进一步增加了其临床相关性。总体而言，这些发现表明，尽管有粘菌素限制政策，^mcr阳性多重耐药细菌仍在泰国食物链中持续存在。

研究结论部分指出，本研究对泰国在全国禁止在食用动物中预防性使用粘菌素后，零售肉中^mcr基因及携带^mcr基因细菌的流行率和分子特征进行了全面评估。在露天市场的鸡肉和猪肉中检测到^mcr-1和^mcr-3，突显了零售肉作为粘菌素耐药性传播的重要储库。值得注意的是，从鸡肉中鉴定出^mcr-1阳性、产ESBL、多重耐药的肺炎克雷伯菌，这是泰国首次报道此类菌株，并引发了在持续抗菌压力下高风险克隆出现的担忧。尽管有粘菌素禁令，^mcr阳性菌株的持续存在表明，其他抗菌药物（特别是在小规模养殖系统中）的持续或不受控制的使用可能维持了它们的传播循环。这些发现强调了对零售肉中^mcr基因进行系统性监测以及在食品生产链中加强抗菌药物管理执行的迫切需求。将零售肉监测纳入泰国“一体健康”抗菌素耐药性框架，对于限制粘菌素耐药性的传播以及保护公共卫生和食品安全至关重要。