单细胞转录组学及禽疟原虫(Plasmodium spp.)配子体特异性分子标记的开发

《Molecular Ecology Resources》：Single-Cell Transcriptomics and Development of Gametocyte-Specific Molecular Markers for Avian Malaria Parasites

　　

由疟原虫(Plasmodium)引起的禽疟疾(Avian malaria)对全球鸟类种群尤其是脆弱的岛屿生态系统构成重大威胁。然而，由于缺乏定量和鉴别可传播阶段——即雄性与雌性配子体(gametocyte)——的分子工具，人们对禽疟疾传播动力学的理解长期受阻。禽类宿主具核红细胞(non-nucleated erythrocytes of avian hosts应为nucleated erythrocytes)及无体外培养体系(in vitro culture system)等问题进一步阻碍了分子方法的发展。本研究开发并验证了首个可区分广泛传播的禽疟原虫——鸡疟原虫(Plasmodium relictum)——无性裂殖体(asexual)、雄性及雌性配子体的分子标记。利用单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)和直系同源引导的阶段映射(orthology-guided stage mapping)，研究人员鉴定了保守的阶段特异性转录本，据此开发了可在两个细胞色素b(cyt-b)谱系pSGS1和pDELURB4中定量并区分雄、雌性配子体的分子标记。这些标记在灵敏度上优于显微镜检查，能更早检出配子体且检出窗口更长，并揭示显微血涂片低估了雄性配子体比例，真实雄雌配子体比值(male-to-female gametocyte ratio)持续高于镜检估计值。这些标记在疟原虫属间高度保守，提示其可广泛应用于其他禽源谱系。

论文解读：单细胞转录组学及禽疟原虫(Plasmodium relictum)配子体特异性分子标记的开发

《Molecular Ecology Resources》刊发的该研究针对禽疟原虫(avian malaria parasite, Plasmodium spp.)传播阶段——配子体(gametocyte)——长期缺乏定量与性别鉴定(sexing)分子工具的瓶颈，首次采用单细胞转录组学(single-cell transcriptomics / single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)结合直系同源映射(orthology mapping)策略，对鸡疟原虫(Plasmodium relictum)感染金丝雀(Serinus canaria)外周血进行无性裂殖体(asexual stage)、雄性配子体(male gametocyte)与雌性配子体(female gametocyte)的阶段特异性基因鉴定，并设计、验证了可分别定量雌雄配子体的qPCR分子标记。研究发现所开发的标记比传统吉姆萨染色(Giemsa-stained)血涂片显微镜检查(microscopy)更灵敏、检出时间窗更长，且分子方法估算的配子体性比(sex ratio)显著偏雄高于镜检结果，揭示了镜检对雌雄配子体形态鉴别的系统偏差。该成果为研究野生鸟类种群中禽疟原虫的传播潜能(transmission potential)、配子体动力学及宿主—寄生虫协同进化提供了可靠的分子手段。

主要关键技术方法

研究人员经腹腔接种感染pSGS1谱系的金丝雀(Serinus canaria)建立急性感染模型，于感染高峰期采集抗凝血；利用基于疟色素(hemozoin)磁珠分选(magnetic cell separation, MACS)富集感染红细胞，经Oxford Nanopore PromethION长读长scRNA-seq建库测序；生物信息学流程使用Seurat进行降维聚类，并通过OrthoMCL直系同源关系将P. relictum基因映射至P. falciparum参考单细胞数据集(scmap包)以完成阶段注释(stage mapping)；依聚类差异表达基因筛选各阶段特异标记并设计跨内含子引物，同时在独立感染实验中以pSGS1和pDELURB4谱系感染金丝雀，纵向多点采样并行开展血涂片镜检与反转录qPCR(reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR)验证标记特异性、灵敏度及与AP2-G（配子体分化关键转录因子AP2-G / PfAP2-G, PRELSG_1438200.1）表达的相关性。

3 Results（结果）

3.1 Single Cell Transcriptomics and Stage-Specific Marker Identification（单细胞转录组学与阶段特异性标记鉴定）

对感染后急性期金丝雀混合血样进行scRNA-seq获得2027个P. relictum高质量单细胞转录本，UMAP聚类分出6个簇(cluster)。通过直系同源映射至P. falciparum Malaria Cell Atlas参考数据集，确定cluster 4为雄性配子体（表达HAP2/GCS1 ortholog），cluster 5为雌性配子体（表达P47 ortholog），clusters 0–3为无性阶段（cluster 3高表达MSP1 ortholog）。据此筛选得到两雄配子体标记基因PRELSG_0509700(M0509, PF3D7_0414500 ortholog, Male development protein MD5)与PRELSG_1409000(M1409, PF3D7_1311100 ortholog, meiosis-specific nuclear structural protein 1)，两雌配子体标记PRELSG_0512300(F0512, PF3D7_0417000 ortholog)与PRELSG_1229400(F1229, PF3D7_0109600 ortholog, LCCL domain-containing protein)，以及两无性期标记PRELSG_0415200(A0415, MSP5 ortholog)与PRELSG_1229000(A1229, Rhoptry neck protein 2/RON2 ortholog)，引物跨越内含子以区分gDNA与cDNA。

3.2 Experimental Validation of Stage-Specific Markers（阶段特异性标记的实验验证）

在pSGS1和pDELURB4感染金丝雀纵向样本中，分子标记拷贝数与镜检配子体计数(r2显著, p<0.0001)及AP2-G拷贝数均呈强正相关。分子标记在32%(pSGS1)和21%(pDELURB4)镜检阴性样本中检出配子体，早于或同步于镜检且持续检出时间更长，其中M1409(雄)和F0512(雌)表现最优。分子估算配子体性比(雄性占比)均值0.53显著高于镜检均值0.33(p=0.022)，提示镜检低估雄性配子体。pSGS1配子体较pDELURB4更早出现(感染后5–7天 vs 10–14天)且峰值较早(10–12天 vs 14–19天)，两谱系配子体动态大致跟随无性期波动。

4 Discussion（讨论与结论翻译/总结）

本研究首次为禽疟原虫P. relictum开发了可定量与鉴别雌雄配子体的阶段特异性qPCR分子标记，克服了禽类含核红细胞宿主背景高及无体外培养体系的传统障碍。scRNA-seq联合直系同源阶段映射成功区分无性、雄配子体与雌配子体细胞群，所选标记（尤其M1409与F0512）在两近缘谱系pSGS1与pDELURB4中灵敏度优于镜检并可延长配子体检出窗口。由于Plasmodium属阶段特异性基因表达模式具高度保守性，这些标记有望推广至更广泛禽疟原虫细胞色素b(cyt-b)谱系。分子标记揭示镜检系统性低估雄性配子体比例，真实性比接近理论预期(近1:1雄性偏向)，符合高分型多样性野外分离株异交(outcrossing)条件下的性分配(sex allocation)理论预测。未来需在遗传距离更远的谱系及野生鸟类中进一步验证，并可探索覆盖从早期配子体定向(commitment, AP2-G调控)至成熟配子体全过程的附加标记。该套工具为从分子、生态与进化视角研究禽疟传播策略及气候变化等因子对传播的影响奠定了基础。

结论：研究人员利用单细胞转录组学与直系同源阶段映射，鉴定并验证了鸡疟原虫(Plasmodium relictum)pSGS1及pDELURB4谱系的雌雄配子体与无性期阶段特异性分子标记，经验证其检测灵敏度高于显微镜、可更早并更持久检出配子体，且分子法估算配子体性比偏雄高于镜检；这些保守标记为禽疟传播动力学及宿主—寄生虫互作研究提供了重要分子工具。