化学合成的、无帽且无poly(A)尾的编码抗原肽的RNA高效诱导抗原特异性CD8+T细胞应答

《Nature Biomedical Engineering》：Chemically synthesized, non-capped and non-polyadenylated peptide-coding RNA efficiently induces antigen-specific CD8+ T cells

　　

摘要：重组（recombinant）体外转录（in vitro-transcribed, ivt）mRNA广泛用于疫苗接种及多种适应证的临床研究。典型mRNA结构包含5′帽（cap）、5′非翻译区（untranslated region, UTR）、起始和终止密码子、3′ UTR及3′ poly(A)尾。本研究违背现有 dogma，证明短链化学合成的缺失部分或全部上述特征的RNA寡核苷酸（oligonucleotide），当其编码被CD8+T细胞识别的表位时，可被有效翻译。其中，研究人员设计的一种称为ChemRNA、结构为5′-OH-AUG-编码序列-3′-OH的RNA，在体外及体内均能强烈刺激抗原特异性CD8+T细胞。该结果挑战了目前对经典mRNA结构的认知，并提出缺陷或假定非编码RNA可能编码人和小鼠主要组织相容性复合体I类（major histocompatibility complex class I, MHC I）相关肽段的可能性。此外，ChemRNA有望克服个体化抗癌疫苗设计与纯化相关的挑战。

论文解读——《Chemically synthesized, non-capped and non-polyadenylated peptide-coding RNA efficiently induces antigen-specific CD8⁺T cells》（Nature Biomedical Engineering）

研究背景与目的

目前基于体外转录（in vitro-transcribed, ivt）mRNA的个性化肿瘤新抗原（neoantigen）疫苗需为每个患者设计并合成DNA模板、进行体外转录、加帽（capping）、加poly(A)尾及复杂纯化，流程繁琐成为规模化应用的瓶颈。常规观点认为功能性mRNA必须具备5′帽（m⁷G cap）和3′ poly(A)尾及UTR才能被核糖体翻译。研究人员假设完全化学合成的、极简短链RNA——仅含起始密码子AUG及表位编码序列，无帽、无poly(A)尾、无UTR及终止密码子（命名为ChemRNA）——能否在免疫细胞中翻译并诱导CD8⁺T细胞应答，从而简化个性化疫苗生产。

主要关键技术方法

研究人员采用固相磷酰胺法化学合成不同长度及修饰的RNA寡核苷酸（ChemRNA）及对照ivt mRNA（含5′人α-珠蛋白UTR、3′ FI元件UTR及110 nt poly(A)尾）。通过脂质体（Lipofectamine MessengerMAX或BioNTech脾靶向脂质体）将RNA转染至小鼠脾细胞、树突状细胞（DC2.4、BMDC骨髓来源DC）、肿瘤细胞（B16-F10、B16/OVA）及人外周血单个核细胞（PBMC，来自健康供者及黑色素瘤患者）。使用OT-1 TCR转基因小鼠T细胞共培养检测IL-2分泌（ELISA），B3Z T细胞杂交瘤检测β-半乳糖苷酶活性，ELISpot检测IFNγ斑点，流式细胞术检测MHC I-四聚体（tetramer）结合CD8⁺T细胞频率及H-2K^b-SIINFEKL复合物（25D1.16抗体），RT-qPCR检测胞内RNA稳定性，NanoBiT/HiBiT系统检测肽段表达。小鼠体内实验采用C57BL/6J雌性小鼠静脉或皮下注射RNA-脂质体复合物（lipoplex），评估血清IFNα、外周血抗原特异性CD8⁺T细胞扩增、B16/OVA或MC-38肿瘤生长抑制及生存曲线。

研究结果

Oligonucleotides encoding the H-2K^bSIINFEKL epitope efficiently stimulate antigen-specific T cells in vitro

测试编码鸡卵清蛋白H-2K^b限制性SIINFEKL表位（MESIINFEKL）的化学合成RNA发现：去除3′ poly(A)尾不影响OT-1 T细胞刺激；进一步去除5′帽（5′-OH、5′-三磷酸、5′-单磷酸效果等同），甚至去除5′ UTR、3′终止密码子仅保留27 nt的5′-OH-AUG-SIINFEKL编码序列-3′-OH（即ChemRNA），仍可有效刺激OT-1 T细胞，缺失AUG则活性降低。DNA寡核苷酸无活性，证实翻译依赖核糖体。ChemRNA与最简ivt mRNA及优化版ivt mRNA体外刺激效果相当。DC2.4细胞可检测到H-2K^b-SIINFEKL表面复合物。在非免疫细胞（B16-F10）中ChemRNA翻译效率低，需IFNα/γ预处理上调MHC I途径；全硫代磷酸酯（phosphorothioate）骨架修饰或5-卤代尿嘧啶修饰可增强其在肿瘤细胞中的表达与抗原呈递。翻译受TAP（transporter associated with antigen processing）及核糖体抑制剂调控，表明ChemRNA与ivt mRNA经相同基础机制产生表位。

ChemRNA encoding HLA-A2- and HLA-B7-binding human viral epitopes leads to the proliferation of antigen-specific CD8⁺T cells in vitro

以相同ChemRNA结构设计编码HLA-A2限制性流感基质蛋白GILGFVFTL、CMV pp65 NLVPMVATV及HLA-B7限制性CMV pp65 TPRVTGGGAM、RPHERNGFTVL，转染HLA配型健康人PBMC后，特异性CD8⁺T细胞发生明显增殖，证明ChemRNA适用于人源病毒表位呈递。

Lipofection of ChemRNA encoding tumour-derived epitopes leads to the stimulation of cancer-specific T cells in vitro

合成编码小鼠MC-38结直肠癌突变表位Adpgk及Rpl18的ChemRNA，转染小鼠BMDC后可有效刺激对应TCR转基因T细胞分泌IFNγ，效果不弱于（Rpl18优于）同等剂量ivt mRNA。编码人黑色素瘤MART-1优化表位ELAGIGILTV的ChemRNA较合成多肽更能诱导HLA-A2⁺黑色素瘤患者PBMC中肿瘤特异性CD8⁺T细胞（IFNγ⁺TNF⁺）增殖。

Vaccination with ChemRNA induces expansion of antigen-specific T cells, restricts tumour growth and results in significantly prolonged survival

静脉注射SIINFEKL ChemRNA-脂质体复合物免疫C57BL/6小鼠，可诱导血清I型IFNα、外周血SIINFEKL特异性CD8⁺T细胞扩增，效果与 capped/polyadenylated ivt mRNA相当。该疫苗显著抑制B16/OVA肿瘤生长并延长小鼠生存期。用MC-38 Reps1新抗原ChemRNA免疫亦可诱导特异性T细胞及一定抗肿瘤保护，但弱于对应ivt mRNA。皮下注射或硫代磷酸酯修饰ChemRNA体内效果相似。

讨论与结论

研究人员发现化学合成的无帽、无poly(A)尾短链RNA（ChemRNA）可在免疫细胞中经核糖体有效翻译并经由MHC I抗原加工提呈途径产生表位，高效诱导抗原特异性CD8⁺T细胞体内外应答，效果在某些情境下等同于经典ivt mRNA。此结果表明缺陷或非经典RNA可能也是MHC I相关肽段的来源，暗示免疫细胞可能存在特殊翻译机制（如hypothesized immunoribosome）。ChemRNA采用固相寡核苷酸合成，可高通量并行合成多样短序列，跳过DNA模板构建与酶促转录步骤，更适于个体化新抗原疫苗的按需快速生产，且避免使用多表位连接肽产生非天然表位。当前挑战在于较长序列（≥66 nt）合成时需达到≥99%纯度以排除(n-1)短片段导致的移码风险。综上，该研究拓展了可翻译RNA的范畴，为个性化抗癌mRNA疫苗提供了简化的新平台。