《Cancer Medicine》：Duocarmycin-Bearing Antibody-Mimetic Drug Conjugate Combined With an ATR Inhibitor Results in Complete Tumor Regression in a KPL-4 Xenograft Model
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抗体-药物偶联物(ADCs)与既往治疗方式相比，在HER2阳性晚期乳腺癌患者中显示出优越的临床结果。然而，在重复给药过程中，耐药性和治疗限制性毒性频繁出现，凸显了对克服ADC失败策略的未满足需求。在本研究中，研究人员探究了抑制共济失调毛细血管扩张突变和Rad3
抗体-药物偶联物(ADCs)与既往治疗方式相比，在HER2阳性晚期乳腺癌患者中显示出优越的临床结果。然而，在重复给药过程中，耐药性和治疗限制性毒性频繁出现，凸显了对克服ADC失败策略的未满足需求。在本研究中，研究人员探究了抑制共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关蛋白(ATR)是否能增强抗体模拟药物偶联物(AMDCs)(一种靶向载荷递送平台)的抗肿瘤疗效。将携带多卡霉素的HER2靶向AMDC(Duo-HER2)与ATR抑制剂联合治疗，在人类HER2阳性乳腺癌异种移植模型中显著增强了抗肿瘤活性。在有限数量的治疗小鼠队列中，该联合治疗诱导了持续的肿瘤抑制，无瘤生存期超过100天。尽管在治疗早期观察到短暂的体重减轻，但未检测到明显的全身毒性证据。使用三种临床相关的ATR抑制剂——tuvusertib、ceralasertib和berzosertib，在体外进一步证实了与Duo-HER2的协同相互作用。短期凋亡分析显示仅诱导了适度的细胞死亡，而较长时间的活力测定显示出显著的生长抑制。细胞周期分析显示S期积累，伴随亚G1群体的轻微增加，表明该联合治疗最初通过复制应激诱导的S期阻滞发挥细胞抑制效应，随后导致延迟的细胞毒性。综上所述，这些发现表明，Duo-HER2联合ATR抑制剂在HER2阳性乳腺癌模型中协同抑制肿瘤生长。需要进一步研究采用优化配方、扩大体内队列和增加肿瘤模型，以充分确定该策略的治疗潜力及其在克服ADC耐药性中的相关性。
**论文解读：Duo-HER2联合ATR抑制剂在HER2阳性乳腺癌模型中的协同抗肿瘤作用**
**研究背景与问题**
抗体-药物偶联物(ADCs)已成为HER2阳性晚期乳腺癌的重要治疗手段，如曲妥珠单抗-emtansine(T-DM1)和曲妥珠单抗-deruxtecan(T-DXd)显著改善了患者预后。然而，临床应用中仍面临两大挑战：一是耐药性频繁出现，机制包括HER2表达下调、内吞和溶酶体加工异常、药物外排转运体诱导等，其中DNA损伤应答(DDR)通路激活（尤其是ATR-CHK1信号上调）被认为是获得性耐药的关键适应性机制；二是ADC的长期循环半衰期和肿瘤穿透性不足导致全身暴露和脱靶毒性。为克服这些限制，研究人员开发了抗体模拟药物偶联物(AMDCs)，其由低免疫原性突变链霉亲和素(Cupid)与抗体模拟靶向模块（如affibody或单链可变区片段）融合，并通过高亲和力双-亚氨基生物素连接子(Psyche)非共价结合Cupid四聚体。AMDC分子量小、血液清除快、肿瘤穿透性佳，可降低全身毒性。此前，研究人员已证实HER2靶向AMDC能高效递送DNA烷化剂多卡霉素(Duocarmycin)进入HER2阳性癌细胞。多卡霉素通过不可逆烷基化腺嘌呤残基，在皮摩尔浓度下即显示强效细胞毒性，但因其治疗指数窄、毒性大，作为游离药物开发被终止，现重新作为ADC载荷进入临床研究。近期研究表明，ADC介导的多卡霉素递送联合DDR抑制剂（尤其是ATR抑制剂）可产生协同杀伤效应，因为多卡霉素诱导复制应激和复制叉停滞，而ATR/CHK1信号是细胞耐受此类损伤的核心机制。基于此，本研究旨在评估携带多卡霉素的HER2靶向AMDC(Duo-HER2)联合ATR抑制剂在HER2阳性乳腺癌模型中的治疗潜力，并探索其协同机制。论文发表在《Cancer Medicine》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：1) 重组蛋白表达与纯化：通过去除His标签的VHH-Cupid融合蛋白表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经包涵体复性和凝胶过滤色谱纯化获得四聚体HER2-Cupid蛋白。2) 复合物形成：将多卡霉素-Psyche与HER2-Cupid按2:1摩尔比混合，经PD-10脱盐柱去除未结合载荷，制备Duo-HER2。3) 体内疗效分析：采用KPL-4人乳腺癌细胞系（来源：Kawasaki医科大学Kurebayashi博士）皮下接种于BALB/cSlc-nu/nu裸鼠，瘤体积>200mm3时分组给药。Duo-HER2组于第0和7天静脉注射200μg/只，联合组加用口服ceralasertib 50mg/kg每日一次连续14天。4) 体外细胞活力测定：使用CCK-8试剂检测6天暴露后的细胞活力，并基于ZIP模型计算协同评分。5) 凋亡与细胞周期分析：通过Annexin V/PI双染和PI染色流式细胞术评估凋亡相关细胞群体和细胞周期分布。所有体外实验均使用三种临床相关ATR抑制剂（tuvusertib、ceralasertib、berzosertib）进行验证。
**研究结果**
**3.1 Duo-HER2与Ceralasertib联合治疗在异种移植模型中有效抑制肿瘤生长**
在KPL-4异种移植模型中，Duo-HER2单药组于第21天后肿瘤复发，第55天因3/5小鼠瘤体积达终止标准而结束实验。联合治疗组（Duo-HER2+ceralasertib）所有4只小鼠均实现无瘤生存超过100天，且无肉眼可见肿瘤复发。组织病理学分析显示，原肿瘤区域仅见纤维化、胆固醇结晶沉积、微钙化和泡沫细胞浸润，无存活肿瘤细胞，其他器官亦未见转移或明显病理异常。联合治疗组早期出现短暂体重减轻，但随后恢复，未影响治疗完成。
**3.2 Duo-HER2与ATR抑制剂在KPL-4细胞中的协同细胞毒性**
在体外，10 ng/mL Duo-HER2单独处理几乎无细胞毒性，而20和30 ng/mL仅引起4%-23%的活力下降。三种ATR抑制剂单独处理的IC50值分别为tuvusertib 133.9 nM、ceralasertib 2.1 μM、berzosertib 949.3 nM。当与10 ng/mL Duo-HER2联用时，ATR抑制剂的IC50值分别降至13.8 nM、339.8 nM和38.1 nM，ZIP协同评分均>10，表明强协同效应。
**3.3 Duo-HER2与Tuvusertib联合增加KPL-4细胞中凋亡相关细胞群体**
Annexin V/PI染色显示，与对照组相比，联合治疗组在72、96和120小时显著增加Annexin V+/PI+（晚期凋亡/死亡）细胞比例（如72小时：4.05% vs 19.66%，p<0.01），且Annexin V-/PI+（裸核）细胞也有增加。单药处理仅引起轻微变化，提示联合治疗诱导了以晚期细胞死亡为主的表型。
**3.4 Duo-HER2与Tuvusertib联合阻滞KPL-4细胞于S期并诱导凋亡**
细胞周期分析表明，联合治疗组在72、96和120小时均显著增加S期细胞比例（如72小时：13.54% vs 26.88%，p<0.01），并伴随亚G1群体轻度但显著性增加（如72小时：0.26% vs 0.75%，p<0.01）。Duo-HER2或tuvusertib单药处理均未引起S期阻滞或亚G1增加，表明联合治疗通过诱导S期阻滞先发挥细胞抑制效应，随后延迟出现细胞死亡。
**总结与讨论**
本研究通过体内外实验证实，Duo-HER2（携带多卡霉素的HER2靶向AMDC）联合ATR抑制剂在HER2阳性乳腺癌模型中产生协同抗肿瘤效应，且机制涉及复制应激诱导的S期阻滞后延迟性细胞死亡。研究结论翻译如下：**结论：将Duo-HER2与ATR抑制剂联合使用，在乳腺癌临床前模型中比任一单药更有效地抑制肿瘤生长。该联合治疗的特征是初始的细胞抑制性S期阻滞，随后延迟诱导细胞死亡，最终在体内实现持久的肿瘤抑制，与多卡霉素诱导的复制应激与ATR通路抑制之间的合成致死样相互作用一致，且可在耐受剂量下实现，同时减轻单药的不良反应。**
讨论部分指出，本研究首次在体内验证了AMDC联合ATR抑制剂的持久抗肿瘤活性（无瘤生存>100天），优于既往报告（如Rieker等用ADC联合ATR抑制剂在胃癌模型中约50天复发）。但仍存在局限性：安全性评估有限（仅观察体重变化，早期减重可能源于配方杂质而非药物毒性）；仅在单一HER2阳性模型进行，需更多模型验证；未进行药代动力学/药效学(PK/PD)分析；未直接检测复制应激标志物（如γH2AX）或ATR/CHK1信号；免疫原性未评估，但已去除His标签，后续需优化配方和质量控制。此外，联合治疗的时间依赖性从细胞抑制到细胞毒性的转变，提示需优化给药顺序和间歇方案。
