肿瘤引流淋巴结通过富集肿瘤反应性效应耗竭CD8+ T细胞塑造肿瘤微环境

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Tumor-draining lymph nodes shape the tumor microenvironment through enrichment of tumor-reactive effector-exhausted CD8+ T cells

　　

肿瘤引流淋巴结（TdLNs）在抗肿瘤免疫中处于核心地位，并影响对免疫治疗的反应。微卫星不稳定（MSI）和微卫星稳定（MSS）的结直肠癌（CRC）在肿瘤生物学、预后和免疫检查点阻断敏感性上存在显著差异。然而，这两种亚型之间TdLNs的差异及其对不同抗肿瘤免疫反应的贡献仍知之甚少。在此，研究人员进行了整合多组学分析，以系统比较这两种结直肠癌亚型的TdLNs和肿瘤微环境（TME）。研究人员鉴定了一群独特的CD8⁺ T细胞，这些细胞表现出终末耗竭同时保留了强抗肿瘤活性。这些细胞高度肿瘤反应性，与三级淋巴结构（TLS）形成相关，并在MSI CRC中富集。谱系追踪表明它们起源于TdLNs。在MSI CRC中，TdLNs含有更多前耗竭T细胞（Tpex）、具有增强抗原呈递能力的树突状细胞（DC）和更少的调节性T细胞（Tregs），从而为这些效应耗竭T细胞（Texeff）的发展提供了前体和支持性微环境。同时，在肿瘤内，IL21⁺CD4⁺ T细胞和CXCL10⁺髓系细胞通过细胞因子信号传导和增加主要组织相容性复合体（MHC）表达促进了这些细胞的分化和招募。MSI CRC肿瘤细胞通过激活环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路进一步增强了这种免疫生态系统。总之，研究人员的发现确定了效应耗竭CD8⁺ T细胞是MSI CRC中有利免疫的关键介质，并强调了TdLNs在塑造肿瘤免疫景观中的关键作用。

**论文解读：肿瘤引流淋巴结与肿瘤微环境协同塑造MSI结直肠癌的免疫优势**

**研究背景与目的**

肿瘤引流淋巴结（TdLNs）作为抗原呈递和T细胞初始活化的核心枢纽，在调节抗肿瘤免疫和影响免疫治疗反应中发挥着关键作用。结直肠癌（CRC）依据微卫星状态分为微卫星不稳定（MSI）和微卫星稳定（MSS）两种亚型，二者在肿瘤生物学、患者预后及对免疫检查点阻断（ICB）治疗的敏感性上呈现巨大差异：MSI肿瘤通常表现出强烈的免疫浸润并对ICB高度敏感，而大多数MSS肿瘤则处于免疫抑制状态且对ICB耐药。然而，这两种亚型在TdLNs中的免疫差异，以及TdLNs如何通过塑造肿瘤微环境（TME）来影响截然不同的抗肿瘤免疫反应，此前尚不清楚。同时，耗竭CD8⁺ T细胞（CD8⁺ Tex）的异质性日益受到关注，但终末耗竭是否必然等同于功能丧失，以及不同耗竭亚型在MSI与MSS CRC中的分布特征，仍有待阐明。为了解决这些问题，研究人员开展了这项整合性研究，旨在系统揭示MSI与MSS CRC中TdLNs和TME的免疫景观差异，并阐明它们如何协同驱动抗肿瘤免疫。

**研究内容与结论**

研究人员对16例CRC患者（7例MSI，9例MSS）的肿瘤组织（CRT）、正常组织（CRN）、TdLNs和外周血单核细胞（PBMC）共58个样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）及配对T/B细胞受体测序（scTCR/BCR-seq），并结合空间转录组学（ST）、多重组化免疫荧光（mIF）和流式细胞术等互补技术，构建了包含195,298个单细胞的转录组图谱。他们鉴定出一群独特的CD8⁺ T细胞——效应耗竭CD8⁺ T细胞（CD8_Texeff），这类细胞虽表现出终末耗竭的转录特征（高表达PDCD1、HAVCR2、LAG3等），却同时保留强大的效应功能（高表达GZMB、IFNG、PRF1）和增殖能力（MKI67⁺）。谱系追踪和TCR分析指出，这些细胞起源于TdLNs中的前耗竭T细胞（CD8_Tpex），并具有最强的肿瘤反应性（约75%携带肿瘤特异性TCR）。在MSI CRC中，TdLNs富含更多的前耗竭CD8⁺和CD4⁺ T细胞（CD4_Tpex）、抗原呈递能力增强的树突状细胞（DC）以及更少的调节性T细胞（Tregs），这为CD8_Texeff的发育提供了充足的“前体库”和有利的“支持性微环境”。同时，MSI肿瘤内富含IL-21⁺CD4⁺ Texeff细胞（通过IL-21/IFN-γ信号促进CD8_Texeff分化）和CXCL10⁺巨噬细胞（通过CXCL9/10-CXCR3轴招募CD8_Texeff），而MSI肿瘤细胞自身则通过激活cGAS-STING通路和上调干扰素刺激基因（ISG），进一步强化了这种免疫生态系统。研究还发现，CD8_Texeff细胞与三级淋巴结构（TLS）的形成密切相关，TLS可能作为T细胞储备库维持抗肿瘤免疫。在临床意义上，CD8_Texeff细胞的丰度与MSI状态、早期肿瘤分期和良好预后相关，并可作为预测免疫治疗反应的生物标志物。基于CD8_Tpex和CD8_Texeff特征开发的免疫潜力（IP）评分，在多个独立队列中有效预测了患者预后和ICB治疗响应，其性能优于单一标志物。该研究揭示了TdLNs在塑造TME中的核心作用，为增强MSS CRC的免疫治疗效果提供了新靶点和策略。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

**主要关键技术方法**

1. **单细胞转录组与免疫组库测序**：对16例CRC患者（初治，来自中国医学科学院肿瘤医院）的肿瘤、正常组织、TdLNs及PBMC进行scRNA-seq和scTCR/BCR-seq，获取195,298个单细胞的转录组和TCR/BCR序列。
2. **多重组化免疫荧光（mIF）**：在组织切片上使用TSA系统进行8色标记，结合HALO软件定量分析CD8、GzmB、PD-1、TCF-1、IL-21、CXCL13等蛋白表达及细胞空间分布。
3. **空间转录组学（ST）**：利用公共ST数据集，通过RCTD推断细胞组成，结合AUCell评分和mistyR分析细胞共定位模式。
4. **流式细胞术**：利用新采集的CRC肿瘤样本，基于PD-1、TCF-1、GzmB等标志物分选CD8⁺ T细胞亚群，检测其细胞内因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）产生能力。
5. **免疫组织化学（IHC）**：在独立的验证队列（140例CRC）中，定量检测STING、PLA2G10、CD20、CXCL13、GZMK等蛋白表达，并结合CD8和CXCL13分析构建IHC-IP评分。

**研究结果**

**单细胞图谱揭示MSI和MSS CRC的TdLNs与原发肿瘤免疫环境**：通过scRNA-seq分析，将细胞分为八大类群。TdLNs以αβ T细胞和B/浆细胞为主，肿瘤组织则以CD8⁺ T细胞浸润为特征。CD8⁺ T细胞进一步分为7个亚群，其中CD8T_CXCL13（后续鉴定为Texeff）在肿瘤中富集，CD8T_CCR7和CD8T_GZMK则在TdLNs中占优势。

**CD8⁺ T细胞在CRC TdLNs和TME中的不同耗竭状态**：基于na?ve、memory、effector和exhaustion评分，将CD8⁺ T细胞分为六种亚型：CD8_Tnaive、CD8_Ttsm（肿瘤特异性记忆T细胞）、CD8_Tpex、CD8_Texint（中间耗竭）、CD8_Texeff和CD8_Texterm（终末耗竭）。TdLNs富含前三种前体亚型，而肿瘤中后三种耗竭/效应亚型占主导。伪时间分析揭示了从Tnaive经Tpex分化为Texeff或Texterm的路径。

**CD8_Texeff细胞展现强抗肿瘤功能和增殖能力**：转录组分析显示CD8_Texeff高表达细胞毒性分子（GZMB、IFNG、PRF1）和免疫检查点（PDCD1、HAVCR2），同时高表达增殖基因MKI67。mIF和流式细胞术证实，CD8_Texeff（TCF-1?PD-1^hiGzmB⁺）细胞是肿瘤中主要的效应细胞亚群，能高效产生IL-2、TNF-α和IFN-γ。

**CD8_Texeff细胞具有最强的肿瘤反应性**：通过scTCR分析，约75%的CD8_Texeff细胞携带肿瘤特异性TCR（优先在肿瘤中克隆扩增的TCR），其克隆扩增程度远超其他亚型。NeoTCR8评分也证实其中位数最高。CXCL13被确认为CD8_Texeff的可靠标志物。

**CD8_Tpex和CD8_Texeff细胞优先富集于MSI CRC**：在TdLNs中，MSI患者CD8+ T细胞更多处于Tpex和Texint状态，MSS则主要为na?ve表型。在TME中，MSI肿瘤中CD8_Texeff丰度显著高于MSS，而MSS中Texint和Texterm更多。mIF和公共数据集验证了这一趋势。MSI来源的Texeff细胞还高表达效应分子、趋化因子和免疫检查点。

**CD8_Texeff细胞的临床意义：与肿瘤分期、预后和免疫治疗反应的关系**：CD8_Texeff在早期（I-II期）肿瘤中更丰富，在高分期MSS样本中显著减少。TCGA数据中，高CD8_Texeff评分与MSS CRC患者更长的总生存期相关。在免疫治疗队列中，治疗后响应者的CD8_Texeff评分升高，且治疗前基线水平高的患者（尤其是完全缓解者）预后更好。

**结合CD8_Tpex和CD8_Texeff特征的免疫潜力评分（IP评分）有效预测不同肿瘤类型的预后和免疫治疗反应**：基于GZMK、CXCL13和CD8A三种基因构建IP评分，在TCGA-COAD中高评分患者生存显著更长。在GSE91061（黑色素瘤/非小细胞肺癌）和GSE93157（黑色素瘤/非小细胞肺癌/头颈鳞癌）数据集中，高IP评分患者治疗响应率更高、无进展生存期更长。IHC验证的IP评分在独立CRC队列中能有效预测复发/转移，且优于单用CXCL13。

**TdLNs中CD4_Tpex与Tregs比例影响TME中CD4_Texeff和CD8_Texeff的分化与富集**：在MSI TdLNs中，CD4⁺ T细胞以Tpex特征为主，Treg比例低，CD4_Tpex/Treg比值高。这有利于CD4_Texeff（Th1样，共表达IL-21、IFN-γ、CXCL13）的分化。在TME中，CD4_Texeff通过IL-21/IFN-γ信号与高表达IL21R/IFNGR1的CD8_Texeff相互作用，空间共定位分析支持这一模型。

**表达干扰素刺激基因（ISG）的髓系细胞在MSI CRC中富集，具有增强的趋化和抗原呈递能力**：MSI肿瘤中的DC和巨噬细胞高表达ISGs（STAT1、IRF7等）、MHC分子及趋化因子CXCL9/10/16。特别是Mac_CXCL10亚群，通过CXCL9/10/11-CXCR3和CXCL16-CXCR6途径活跃地招募CD8_Texeff和CD4_Texeff细胞，空间转录组数据证实二者在肿瘤-基质交界处共定位。

**MSI CRC中TLS形成增加，促进抗肿瘤免疫**：MSI肿瘤中TLS密度（尤其在浸润边缘）显著高于MSS。TLS形成与CXCL13⁺Texeff细胞丰度正相关，且TLS内部含有TCF-1⁺PD-1⁺的Tpex细胞和分泌IL-21/IFN-γ的CD4⁺ T细胞，提示TLS可能作为T细胞储备和再激活的场所。

**MSI CRC肿瘤细胞呈现干扰素驱动的特征，促进适应性抗肿瘤免疫**：通过非负矩阵分解（NMF）分析，MSI肿瘤细胞富集与T细胞激活、IFN-γ/TNF-α反应相关的转录程序（p2、p4），高表达MHC-II分子和CXCL10。MSI肿瘤细胞具有更高的干扰素反应评分和cGAS-STING通路活化评分，IHC证实STING蛋白表达更高。相反，MSS肿瘤细胞上调PLA2G10，其表达与CD8⁺ T细胞浸润负相关，提示其为免疫排斥因子。

**总结与讨论**

本研究首次系统比较了MSI与MSS CRC中TdLNs与TME的免疫差异，揭示了TdLNs通过提供前耗竭T细胞和支持性微环境，驱动肿瘤内CD8_Texeff细胞富集的机制。讨论部分强调，CD8_Texeff细胞虽表型上耗竭但功能活跃，是MSI CRC中抗肿瘤免疫的主力军，其起源与分化和TdLNs的免疫状态密切相关。TdLNs中高比例的Tpex、活化DC及低丰度Tregs，与肿瘤内Th1样CD4_Texeff、CXCL10⁺巨噬细胞以及肿瘤细胞自身的cGAS-STING激活通路相互协同，构建了一个偏好产生和维持CD8_Texeff的免疫生态系统。此外，TLS作为淋巴样“前哨站”也参与其中。这些发现不仅解释了MSI CRC为何对ICB反应良好，也为改善MSS CRC免疫治疗疗效提供了新思路：例如，通过调节TdLNs的免疫状态、增加Tpex库或阻断PLA2G10来促进CD8_Texeff的生成。研究结论翻译为：总之，本研究确定了CD8_Texeff细胞是MSI CRC良好预后和增强免疫治疗反应的关键贡献者，并强调了TdLNs在CD8_Texeff细胞发育和招募中的关键作用。这项工作不仅揭示了MSI CRC增强抗肿瘤免疫的机制，还为增强免疫治疗反应（尤其是对MSS CRC患者）提供了新的治疗策略。