壳聚糖/β-环糊精纳米载体通过pH响应释放及凋亡调控增强5-氟尿嘧啶抗结直肠癌疗效

《Scientific Reports》：Chitosan/β-cyclodextrin nanocarriers enhance 5-fluorouracil efficacy against colorectal cancer via pH-responsive release and apoptosis modulation

　　

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）目前仍是全球范围内导致癌症相关死亡的主要原因之一。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）作为CRC治疗的一线化疗药物，其临床应用受到生物利用度降低和剂量限制性毒性等因素的制约。为克服上述局限，研究人员在本研究中构建了一种三元药物递送系统。壳聚糖（Chitosan, Chs）与β-环糊精（β-Cyclodextrin, β-CD）通过物理组装形成伪聚轮烷（Pseudopolyrotaxane）复合物，继而采用溶剂蒸发法将5-FU载入形成固体分散Blueprint。所得纳米复合物的平均流体力学直径为187 nm，Zeta电位为+32.5 mV。傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）分析显示特征峰位移，与非共价相互作用相符。X射线衍射（X-Ray Diffraction, XRD）证实了5-FU在制剂中的非晶化。该三元系统在pH 5.5条件下的5-FU释放速率显著高于pH 7.4。在HCT-116结直肠癌50）为16.5 μM，而游离5-FU为42.5 μM，二元5-FU/β-CD复合物为27.5 μM。基因表达分析显示P53和Caspase-3上调，BCL2和血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）下调。针对公共数据集GSE183977中5-FU响应基因的互补计算分析鉴定出一个蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，该网络在凋亡和细胞周期通路中富集，并以白细胞介素6（Interleukin-6, IL6）、MYC、早期生长反应1（Early Growth Response 1, EGR1）和活化转录因子3（Activating Transcription Factor 3, ATF3）为中心枢纽基因。研究结果表明，将5-FU嵌入壳聚糖/β-环糊精基质可增强其对结直肠癌结直肠癌作为全球第二大癌症相关死因、第三大常见恶性肿瘤，2020年GLOBOCAN数据显示其新发病例约193万、死亡约93万例，占全球癌症负担近10%。预计到2040年，发病率和死亡率将分别上升63%和73%，主要受饮食、生活方式及炎症风险因素驱动。尽管化疗、放疗和手术取得进展，晚期结直肠癌仍面临全身毒性、药物吸收不良及化疗耐药等问题，治疗结局不理想。5-氟尿嘧啶作为结直肠癌一线化疗药物，通过抑制胸苷酸合成酶（Thymidylate Synthase, TS）干扰DNA和RNA合成，但其快速代谢、短血浆半衰期以及骨髓抑制、黏膜炎等毒性限制了临床应用。此外，DNA修复系统增强和抗凋亡信号介导的药物耐药进一步削弱5-氟尿嘧啶疗效。纳米颗粒药物递送系统通过延长循环时间、减少全身副作用、增强药物稳定性，并可借助增强渗透和滞留效应（Enhanced Permeability and Retention Effect, EPR效应）实现靶向，为克服上述局限提供了新策略。

天然高分子载体中，壳聚糖和β-环糊精因其功能化潜力、生物可降解性和生物相容性而备受关注。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化获得的阳离子多糖，其质子化氨基赋予其在酸性肿瘤微环境中的pH响应溶胀特性，正表面电荷增强与细胞膜的静电相互作用，促进吸附内吞并改善黏膜黏附。β-环糊精是由七个锥形吡喃葡萄糖单元组成的环状寡糖，其疏水空腔可与多种药物形成包合物。将5-氟尿嘧啶包载于β-环糊精可稳定药物、防止水解和酶解破坏并实现可控释放。将β-环糊精与壳聚糖整合为杂化纳米载体，兼具稳定性改善、黏膜黏附性增强、载药量提高及pH响应释放等优势。

本研究旨在开发一种三元5-氟尿嘧啶/壳聚糖/β-环糊精纳米载体，通过平行体外和计算方法评估其对HCT-116结直肠癌
研究人员采用的关键技术方法包括：通过溶剂蒸发/共沉淀法制备三元制剂，采用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测定粒径和Zeta电位，X射线衍射分析晶型，傅里叶变换红外光谱表征分子间相互作用，扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察形貌；体外释药采用透析袋扩散法；细胞毒性通过磺胺罗丹明B（Sulforhodamine B, SRB）比色法评估；基因表达采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）检测P53、Caspase-3、BCL2、VEGF；计算分析利用Gene Expression Omnibus（GEO）公共数据库中的GSE183977数据集（含2例HT29人结直肠癌
物理化学表征结果显示：X射线衍射表明纯5-氟尿嘧啶呈结晶态，二元复合物中特征峰强度降低、峰形展宽，三元体系中5-氟尿嘧啶结晶峰被抑制，且壳聚糖特征峰发生位移，提示逐步包封过程。动态光散射显示三元制剂呈单峰分布，平均粒径187.3±12.6 nm，多分散指数（Polydispersity Index, PDI）0.214±0.031，Zeta电位+32.5±4.2 mV，4℃储存14天粒径增长<8%、Zeta电位下降<13%，显示良好的胶体稳定性。扫描电子显微镜显示纯5-氟尿嘧啶为不规则大角状晶体，二元复合物为板状 elongated 颗粒，三元制剂则为不规则多孔纳米聚集体。傅里叶变换红外光谱中，5-氟尿嘧啶的N-H伸缩振动、C-H伸缩振动和C=O伸缩振动峰在三元体系中分别位移至3581.16 cm^-1、2920.66 cm^-1和1725.01 cm^-1，证实包合复合物形成及分子间氢键作用。

相溶解度研究表明，β-环糊精与5-氟尿嘧啶形成1:1包合物，表观稳定常数（Ks）136.2 M^-1，属弱包合亲和力；而壳聚糖/β-环糊精伪聚轮烷系统使5-氟尿嘧啶溶解度提升5.86倍，较β-环糊精单独使用额外增加2.6倍。三元制剂载药量（Drug Loading Content, DLC）18.6±1.2%，包封率（Encapsulation Efficiency, EE）74.3±3.5%，优于多数文献报道的壳聚糖纳米颗粒或β-环糊精包合物。

体外释药研究显示，72小时内pH 7.4条件下累积释放67.37%，pH 5.5条件下达87.35%，各时间点差异显著（p<0.001）。酸性条件下的加速释放归因于壳聚糖pKa约6.5，在pH 5.5时胺基质子化导致基质溶胀、促进药物扩散。

体外细胞毒性结果中，游离5-氟尿嘧啶、二元复合物和三元制剂的IC₅₀分别为42.5 μM、27.75 μM和16.5 μM，纳米制剂使细胞毒性增强约2.6倍。

体外基因表达分析显示，三元制剂组Caspase-3表达上调3.72倍、P53上调3.63倍，均显著高于游离药物组（1.85倍、1.92倍）和二元复合物组（2.48倍、2.51倍）；BCL2表达在三元组降至0.48倍，而游离药物组反常上调至1.35倍；VEGF表达在三元组降至0.32倍。上述结果表明三元制剂更有效激活内在凋亡通路并抑制血管生成信号。

计算网络药理学与功能富集分析显示：差异表达基因分析鉴定33个上调和217个下调基因；PPI网络包含112个节点和170条边，富集极显著（P<1.0×10^-16）；CytoHubba度分析确定前十名枢纽基因为IL6（度=30）、MYC（16）、EGR1（14）、BMP4（13）、ATF3（12）、IFNL3（11）、IFNL2（11）、CXCL1（11）、CCN1（10）和IL19（10）。功能富集分析显示，差异表达基因在"细胞因子介导的信号通路"（错误发现率FDR=8.77×10^-5）中显著富集，涉及EGR1、IFNL2、IL19、CXCL1、IL6、IFNL3和MYC等七个枢纽基因。此外，"对有机物质的细胞反应"、"化学反应"、"细胞死亡的正调控"、"凋亡过程的正调控"等生物学过程亦显著富集。通路层面，丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）级联调控和Janus激酶-信号转导及转录激活因子（JAK-STAT）受体信号通路等显著富集。

讨论与结论部分指出，体外与计算数据呈现一致的机制图景。pH响应释放产生持续的细胞内药物浓度，足以激活P53-Caspase-3轴并抑制BCL2，同时避免游离药物递送时伴随的BCL2反常上调所反映的急性生存反应。网络分析将IL6-STAT3信号和MYC/EGR1应激转录轴确定为5-氟尿嘧啶重塑结直肠癌转录组的主要节点。纳米载体制剂在体外表现出的更强凋亡和血管生成标志物调控，与其持续药物暴露足以克服网络分析中鉴定的IL6介导的耐药机制相一致。

研究结论表明，通过物理组装壳聚糖与β-环糊精形成伪聚轮烷复合物、再以溶剂蒸发法载入5-氟尿嘧啶构建的三元药物递送系统，平均粒径187 nm、Zeta电位+32.5 mV，在pH 5.5时较pH 7.4更快释放5-氟尿嘧啶。在HCT-11650为16.5 μM earnings，较游离5-氟尿嘧啶降低约2.6倍，伴随P53和Caspase-3更强上调及BCL2和VEGF更显著下调。计算分析鉴定IL6、MYC、EGR1和ATF3为与凋亡和细胞周期调控相关的枢纽基因。上述结果提示，将5-氟尿嘧啶嵌入壳聚糖/β-环糊精基质可通过改善溶解度、持续释放及增强凋亡通路 Engagement 提高其抗结直肠癌

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