去泛素化酶USP25通过稳定C1ql4促进乳腺癌干性及恶性进展

《Scientific Reports》：The deubiquitinase USP25 contributes to stemness and malignant progression of breast cancer by stabilizing C1ql4

　　

乳腺癌（BC)仍然是女性最具侵袭性和致命性的癌症类型之一。癌症干细胞（CSCs)与癌症的进展和转移密切相关。本研究旨在探讨泛素特异性蛋白酶25（USP25)在乳腺癌转移和干性中的作用。研究人员采用细胞计数试剂盒8（CCK-8)和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EDU)实验测定细胞活力和增殖能力；建立异种移植瘤模型以确定癌细胞的体内生长情况；采用流式细胞术检测细胞凋亡；通过蛋白质免疫印迹（Western blot)和定量实时聚合酶链式反应（qPCR)评估凋亡和癌症干性标志物的表达；通过球形成实验分析癌细胞的自我更新能力；收集临床样本检测USP25和C1ql4（C1q-like 4)的表达。USP25敲低可抑制乳腺癌细胞的体外和体内生长，促进细胞凋亡，抑制自我更新能力，下调癌症干性标志物的表达，并降低C1ql4蛋白的稳定性，而过表达C1ql4可逆转这些效应。临床分析表明，USP25和C1ql4在乳腺癌组织中高表达，并呈现正相关性。研究数据表明，USP25敲低通过降低C1ql4蛋白的稳定性来抑制乳腺癌细胞的干性生长。这些发现提示USP25/C1ql4可作为乳腺癌的潜在治疗靶点。

乳腺癌作为全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一，其复发与转移仍是导致患者死亡的主要原因。尽管早期诊断技术和综合治疗手段不断进步，部分乳腺癌仍表现出高度侵袭性，易发生复发或远处转移。研究表明，肿瘤内存在一类具有干细胞特性的细胞亚群，即癌症干细胞（CSCs），这类细胞具有多向分化潜能、自我更新能力及干性基因表达特征，与肿瘤的启动、进展、转移、耐药及复发密切相关。因此，深入探究驱动乳腺癌转移和干性的分子机制，对于发现特异性治疗靶点、改善患者预后具有重要意义。

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰方式，通过将泛素多肽以单体或多聚链形式连接到底物蛋白上，调控蛋白质的活性、稳定性、亚细胞定位、蛋白间相互作用及其被26S蛋白酶体降解的过程，广泛参与细胞生长、分化及炎症反应等基本生物学行为的调控。去泛素化酶（DUBs)可逆转泛素化修饰，在维持蛋白质稳态中发挥重要作用。泛素特异性蛋白酶25（USP25)是一种去泛素化酶，已被报道在肿瘤发生和免疫应答中发挥多效性作用，但其在乳腺癌进展中的功能尚不明确。

C1q样蛋白（C1ql)家族是经典补体途径的起始分子，可识别免疫复合物并激活补体系统的经典途径。该家族包含四个高度保守的成员：C1ql1（CTRP14)、C1ql2（CTRP10)、C1ql3（CTRP13)和C1ql4（CTRP11)。已有研究表明，C1ql1可促进胶质瘤发展，介导神经干细胞样细胞向胶质细胞转化；而C1ql4在乳腺癌细胞系和临床组织中高表达，与患者恶性程度相关。基于上述背景，研究人员深入探讨了USP25在乳腺癌恶性进展和干性中的调控作用及其潜在分子机制，相关成果发表于《Scientific Reports》。

本研究主要采用以下关键技术方法：利用人乳腺癌MDA-MB-231和BT549细胞系进行体外功能实验；通过siRNA转染实现基因敲低，通过pcDNA3.1载体构建实现基因过表达；采用环己酰亚胺（CHX) chase实验检测蛋白质半衰期；通过共免疫沉淀（Co-IP)技术验证蛋白间相互作用；建立裸鼠异种移植瘤模型进行体内功能验证；收集承德医学院附属医院50例乳腺癌患者手术切除的肿瘤组织及配对癌旁非肿瘤组织进行临床相关性分析。

USP25促进乳腺癌细胞的恶性表型。研究人员首先在MDA-MB-231和BT549细胞中转染USP25 siRNA，证实敲低效率后选用siRNA-1进行后续实验。CCK-8和EdU检测结果显示，USP25敲低显著降低两种乳腺癌细胞的活力与增殖能力；流式细胞术结果显示细胞凋亡增加，伴随Bcl-2蛋白表达下调及Bax、cleaved caspase-3表达上调；球形成实验表明细胞自我更新能力受抑；qPCR和Western blot显示干性标志物ALDH1和OCT4的mRNA及蛋白水平均降低；Transwell侵袭实验显示细胞侵袭能力明显减弱，上皮-间质转化（EMT)相关标志物蛋白水平显著下降。这些数据表明USP25在体外促进乳腺癌细胞的恶性表型。

USP25促进乳腺癌的体内肿瘤生长。研究人员将转染USP25 siRNA的MDA-MB-231细胞接种于裸鼠，观察其对体内肿瘤生长的影响。结果显示，USP25耗竭可显著抑制裸鼠移植瘤的体积和重量；免疫组织化学（IHC)检测显示肿瘤组织中USP25和Ki-67表达降低；Western blot显示Bcl-2水平下降而Bax、cleaved caspase-3水平升高；干性标志物ALDH1和OCT4的表达受到抑制；细胞周期相关蛋白水平显著降低。以上结果表明USP25在体内促进乳腺癌肿瘤生长。

USP25维持C1ql4蛋白稳定性。为探究USP25发挥作用的分子机制，研究人员通过Co-IP实验证实USP25与C1ql4在MDA-MB-231和BT549细胞中存在相互作用；USP25敲低后两种细胞中C1ql4蛋白表达降低；CHX处理后的时间梯度实验显示，USP25耗竭缩短C1ql4蛋白半衰期，提示USP25对C1ql4蛋白稳定性至关重要。临床样本分析显示，50例乳腺癌组织中USP25和C1ql4的mRNA水平均高于配对癌旁组织，且两者表达呈显著正相关。此外，Co-IP实验表明USP25敲低后C1ql4的泛素化水平显著升高，进一步证实USP25通过去泛素化作用稳定C1ql4。

USP25通过C1ql4增强乳腺癌细胞恶性表型。为验证C1ql4是否介导USP25的促癌功能，研究人员在USP25敲低的MDA-MB-231和BT549细胞中过表达C1ql4。Western blot证实C1ql4过表达可恢复因USP25敲低而降低的蛋白水平；功能 rescue 实验显示，C1ql4过表达可逆转USP25敲低引起的增殖抑制、凋亡促进、球形成能力下降及干性标志物下调；同时可恢复EMT相关蛋白变化和细胞周期进程。体内实验进一步证实，C1ql4过表达可恢复USP25敲低对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。这些结果表明USP25通过稳定C1ql4促进乳腺癌细胞的恶性表型。

在讨论部分，研究人员指出癌症干细胞具有高增殖、自我更新和多向分化能力，与肿瘤的起始、发展、转移和复发密切相关，其迁移和侵袭能力使其能够播散至远处器官。既往研究表明USP25参与多种病理过程，可通过稳定不同底物以情境依赖方式调控肿瘤进展，但其在乳腺癌干性和恶性行为中的作用尚不清楚。本研究首次明确USP25是乳腺癌干性和恶性进展的正向调控因子，其高表达有助于维持乳腺癌细胞的侵袭性和干性特征。机制上，USP25通过与C1ql4相互作用，去除C1ql4蛋白上的泛素链，延缓其被蛋白酶体降解，从而维持C1ql4蛋白稳定性；临床样本中两者的正相关性进一步支持该调控轴的病理意义。研究人员前期研究已证实C1ql4通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进乳腺癌干性和EMT，结合本研究结果，推测USP25介导的C1ql4稳定化可能激活下游致癌信号通路，参与癌症干细胞的维持。研究人员也坦承本研究尚未解决USP25调控的上游信号及下游通路问题，特别是缺氧、慢性炎症信号等肿瘤微环境因素是否参与USP25的上调调控，有待未来研究系统阐明。

研究结论：研究人员探讨了USP25在乳腺癌中的表达和功能，证明USP25敲低可抑制乳腺癌细胞的增殖和干性，并促进C1ql4蛋白降解；C1ql4过表达可逆转siUSP25的效应。研究提示USP25/C1ql4可能成为乳腺癌转移的潜在治疗靶点。