综述：GRK2抑制剂开发的最新进展：阻断GRK2与其相互作用蛋白的结合

《Acta Pharmacologica Sinica》：Recent advances in the development of GRK2 inhibitors: blocking the interaction of GRK2 with its partners

　　

G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）是信号转导中的关键分子，包含N端、激酶结构域（KD）和C端。GRK2构象的变化调节其变构效应，包括KD闭合和蛋白质结合，而KD与pleckstrin同源结构域（PH结构域）之间的相互作用调节GRK2的激酶活性。GRK2作为一个复杂的相互作用组中的中枢分子，除了与G蛋白偶联受体（GPCRs）相互作用外，还与多种细胞质或膜蛋白相互作用，并在多种GRK2功能障碍相关疾病（包括关节炎和心血管疾病）中发挥重要作用。近年来，研究人员基于靶向阻断GRK2–Gαq界面、GRK2–Gβγ相互作用和GRK2 KD–底物结合，开发了GRK2抑制剂（包括肽类抑制剂、RNA适体和小分子化合物），为治疗GRK2功能障碍相关疾病带来了希望。然而，由于一些小分子抑制剂的不利特性和肽类的快速降解，这些GRK2抑制剂进入临床试验的机会有限。了解GRK2的调节、活性、水平或特异性相互作用对于克服这些挑战和优化GRK2抑制剂的临床应用至关重要。研究人员当前的综述讨论了GRK2的结构与功能、GRK2抑制剂的研究进展以及GRK2抑制剂在GRK2功能障碍相关疾病中的调节作用，以期为GRK2靶向治疗的广泛研究提供重要的理论基础。

GRK2的原子结构和动态构象状态

GRK2（也称为βARK1）由N端、激酶结构域（KD）和C端组成。N端（Met1-Ile184）包含αN螺旋和调节G蛋白信号转导同源结构域（RH域），前者对受体磷酸化至关重要，后者由α4–α7螺旋形成的RH束亚域和α1–α3、α8–α9螺旋形成的末端亚域构成，二者形成V形切迹，与KD的小叶和大叶接触。RH域通过与KD和PH结构域相互作用调节激酶活性。KD（His185-Ile513）包含关键氨基酸Lys220，决定激酶活性，由小叶（186–272 aa和496–513 aa）和大叶（273–475 aa）组成，小叶的β1–β2转角形成磷酸结合甘氨酸富集环（P-loop），直接结合ATP的三磷酸尾；大叶包含β6–β9片层和αD–αJ螺旋，C端尾（C-tail）插入αJ和αK螺旋之间，其中AST区（474–498 aa）构成核苷酸门控，控制核苷酸进入和离开激酶活性位点。C端（Ser514-Leu689）包含pleckstrin同源结构域（PH域）（553–661 aa）和C端αCT域（637–659 aa），PH域的β1片层和αC螺旋与RH末端亚域的α1和α9螺旋形成结构界面，为变构调节提供基础。GRK2采取两种主要构象：开放（非活性）状态和闭合（活性）状态。无激动剂刺激时，GRK2以开放构象为主，N端无序，AST区部分有序；ATP结合后KD部分闭合，AST区有序化，但N端仍无序。底物蛋白（如Gαq结合RH域、Gβγ结合PH域）结合可变构诱导激酶闭合，使RH和PH域靠近，促进KD围绕ATP和底物闭合，并完全有序化AST区。这种选择性分子识别模式为靶向GRK2–Gαq界面、GRK2–Gβγ相互作用和KD–底物相互作用提供了结构基础。

GRK2的结合伙伴和功能角色

GRK2作为Gαq偶联信号中的反馈抑制剂：GRK2的RH域特异性与Gαq家族成员（Gαq、Gα11、Gα14）相互作用。GRK2通过磷酸化Gαq偶联受体的丝氨酸/苏氨酸残基，募集β-arrestin（β-arr）和Src，启动细胞外信号调节激酶（ERK）信号；同时，GRK2独立于激酶活性结合并隔离活化的Gαq亚基，抑制磷脂酶Cβ（PLCβ）活性。此外，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）通过活化GRK2参与早期负反馈；钙调蛋白（CaM）与Ca²⁺协同结合并隔离GRK2；蛋白激酶C（PKC）通过磷酸化Ser29增强GRK2活性；c-Src通过磷酸化Tyr13、86和92增加GRK2对GPCR的激酶活性和与Gαq的相互作用。这些多层次的调节使GRK2成为Gαq诱导信号的多级制动器。

Gβγ蛋白介导GRK2向质膜的转位：Gβγ亚基通过其C端半胱氨酸残基与质膜连接，并在受体活化后与GRK2的PH域结合，将GRK2从胞质募集到质膜。PIP2和磷脂酰丝氨酸（PS）与Gβγ协同结合PH域，促进GRK2活化和膜定位。蛋白激酶A（PKA）通过磷酸化Ser685增强Gβγ与GRK2的相互作用，AKAP79调控PKA与受体的复合物形成，磷酸二酯酶-4（PDE4）通过控制cAMP基础水平调节PKA对GRK2的磷酸化，而ERK1/2通过磷酸化Ser670强烈破坏GRK2–Gβγ相互作用，抑制GRK2转位。

GRK2通过直接相互作用调节GPCR的磷酸化依赖和磷酸化非依赖脱敏：GRK2主要磷酸化GPCR第三胞内环（ICL3）和C尾的丝氨酸/苏氨酸残基，诱导构象变化，促进arrestin结合，导致G蛋白信号关闭和受体脱敏、内化、下调。该过程涉及β2-肾上腺素受体（β2-AR）、CC趋化因子受体2/4（CCR2/4）、μ-阿片受体（MOR）等。此外，GRK2通过其N端RH域与受体和Gαq相互作用，介导磷酸化非依赖脱敏，涉及血栓素A2受体（TXA2R）、M1/M3毒蕈碱受体等。

GRK2磷酸化非GPCR底物并参与蛋白结合网络：GRK2磷酸化多种非GPCR膜受体，如胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）、表皮生长因子受体（EGFR）、血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）、上皮Na⁺通道（ENaC）、Smoothened（Smo）、CD36等，并磷酸化胞质和核蛋白，包括：Nedd4-2（Thr466）激活ENaC；DNA甲基转移酶1（DNMT1）稳定化；核因子κB（NF-κB）抑制蛋白α（IκBα）磷酸化增强NF-κB活性；p38MAPK（Thr123）磷酸化失活；丙酮酸激酶M2（PKM2）（Ser406）抑制有氧糖酵解；组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）激活；人抗原R（HuR）（Thr142）促进HIF-1α核积累；肿瘤蛋白53（p53）（Thr55）促进降解；Snail1（Ser90）抑制上皮-间充质转化；腺瘤性息肉病蛋白（APC）抑制Wnt信号；MST2介导中心体分离；Smad2/3负调控TGF-β信号；胰岛素受体底物1（IRS1）（Ser307）损害胰岛素信号；AMP活化蛋白激酶（AMPK）（Ser485）促进肝脏糖异生；线粒体融合蛋白1/2（MFN-1/2）促进线粒体融合。GRK2还以磷酸化非依赖方式与多种蛋白相互作用：与网格蛋白和小窝蛋白结合调节受体内化；与PKCβ1、AKT、PI3K相互作用影响心血管疾病和癌症；与多聚A结合蛋白胞质1（PABPC1）影响mRNA稳定性；与T细胞受体（TCR）促进T细胞活化；与肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）诱导EP4脱敏；与Hedgehog受体Patched1（PTCH1）缓解对其抑制；与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）抑制血管生成；与NF-κB1 p105负调控ERK；与SAV1促进降解导致滑膜增生；与Janus激酶1（JAK1）抑制STAT3信号；与ZFP36L1促进抗体分泌细胞迁移；与ZBTB16负调控GRK2表达；与长链非编码RNA ANRIL激活PI3K/AKT/BCL-2通路；与MALT1抑制其蛋白酶活性；与MEK负调控ERK，与GIT1正调控ERK；与NADPH氧化酶4（NOX4）促进活性氧产生；与TGF-β1协同促进心脏肥大和纤维化；与动力相关蛋白1（Drp1）影响线粒体功能；与SYNJ2BP促进受体磷酸化；与热休克蛋白90（HSP90）调节胚胎发育；与脑蛋白和黑视蛋白（Opn3/4）调节血管光舒张反应；与RalA抑制D2受体磷酸化和内化。

GRK2活化、表达和降解的调控：GRK2活性受PKC、c-Src、PKA、PDGFRβ、EGFR对丝氨酸（S29、S685）和酪氨酸（Y13、Y86、Y92、Y553、Y651）的磷酸化增强，而一氧化氮（NO）和S-亚硝基硫醇（SNOs）对Cys340的S-亚硝基化抑制其活性。GRK2稳定性受Mdm2介导的泛素化降解调控，真核起始因子3d（EIF3d）和长链非编码RNA尿路上皮癌相关1（UCA1）促进其泛素化和降解。

GRK2抑制剂的开发

靶向抑制GRK2–Gαq界面：来源于GRK2 N端RGS域的肽βARKrgs（50–145 aa）通过抑制Gαq而非直接抑制GRK2，在动物模型中预防Gαq介导的心脏肥厚，但面临口服生物利用度低、快速蛋白水解降解和依赖基因递送等挑战，处于临床前阶段。

靶向抑制GRK2–Gβγ相互作用：重组C端域βARKct（495–689 aa）包含Gβγ结合域，可阻断GRK2膜转位和活化，在多个心力衰竭动物模型中显示心脏保护作用，但依赖病毒载体递送（如AAV6-βARKct），仍处于临床前阶段。小分子M119通过虚拟筛选发现，对Gβγ亚基具有高亲和力，其类似物gallein干扰Gβγ结合GRK2，抑制GRK2膜定位和受体磷酸化，在心肌功能障碍和骨关节炎中显示疗效，但因Gβγ参与多条信号通路而存在脱靶效应，均处于临床前阶段。

靶向抑制GRK2-底物结合：GRK2 KD中αF–αG螺旋片段（383-KLLRGHSP-390，称HJ环）的肽可阻止激酶-底物结合所需的构象转变。基于此开发的环肽（KRX-C7、KRX-683）通过侧链环化提高稳定性、选择性和抑制活性，在2型糖尿病动物模型中显示降糖作用，但仍处于临床前阶段。RNA适体C13选择性抑制GRK2（IC₅₀约4.1 nM），通过结合KD大叶的碱性区域并定位其发夹环中的腺嘌呤核苷酸至ATP结合口袋发挥作用，但尚未进行体内测试。小分子化合物中，天然产物balanol作为非选择性ATP竞争性抑制剂抑制GRK2（IC₅₀约42 nM）和GRK5；Takeda抑制剂（CMPD101 IC₅₀=290 nM、CMPD103A IC₅₀=54 nM）对GRK2高度选择且膜通透，但存在CYP3A4抑制问题；FDA批准的帕罗西汀（IC₅₀=20 μM）通过其苯并二氧杂环与铰链区形成氢键，稳定GRK2非活性构象，其类似物（Compound 14as IC₅₀=30 nM、CCG258208 IC₅₀=30 nM、CCG258747 IC₅₀=18 nM）具有更高效力和选择性，帕罗西汀在III期临床试验（NCT06231745）中作为类风湿关节炎（RA）的辅助治疗。此外，芍药苷-6′-O-苯磺酸酯（CP-25，IC₅₀约0.24 μM）通过氢键结合K220、Ala321等残基抑制GRK2，在RA、系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、银屑病和肾纤维化等模型中显示疗效，处于临床前阶段。

总结与展望

GRK2是广泛表达的关键调节蛋白，其构象动态取决于αN螺旋、RH域和PH域的相互作用以及激活伙伴（如激动剂结合的GPCR、Gβγ和PIP2）。GRK2活性和表达增加促进其与GPCR、Gα、Gβγ、PI3K、AKT等多种蛋白的相互作用，形成复杂相互作用组，参与GRK2功能障碍相关疾病的发展。GRK2抑制剂按靶向相互作用界面分类为肽类抑制剂、RNA适体和小分子化合物，各自具有优点和局限性：肽类高特异性但药代动力学障碍大；RNA适体选择性强但稳定性差；小分子ATP竞争性抑制剂渗透性好但选择性不足和脱靶毒性风险。为推进临床转化，未来研究方向包括：开发靶向GRK2独特构象状态的变构抑制剂（如针对RH域的非ATP竞争性抑制剂C3Z392和C5Z299）；基于疾病特异性通路的合理联合治疗（如RA中CP-25联合甲氨蝶呤提高疗效）；利用条件性基因模型进行细胞类型特异性功能研究（如巨噬细胞特异性GRK2敲除小鼠鉴定最佳细胞靶点）。克服选择性和药代动力学挑战是GRK2靶向治疗成功的关键。