基于热力学调控的一锅法CRISPR平台用于即时SNP基因分型

《Nature Communications》：Thermodynamically programmed one-pot CRISPR platform for point-of-care SNP genotyping

　　

摘要

一锅法CRISPR诊断技术存在一个根本性的矛盾：等温核酸扩增能够快速积累目标序列，而CRISPR的激活则会不可逆地消耗这些底物，从而破坏反应动力学。我们发现，通过热力学设计，可以将反应顺序编码到DNA引物中。不同的引物结合强度可形成两个连续的扩增阶段，从而在无需物理分离或外部控制的情况下，等待足够量的扩增产物积累后再启动CRISPR激活。该设计还通过引物引入了CRISPR识别所必需的短序列——原间隔序列相邻基序（PAM），而非依赖目标序列本身含有该基序，这样既提升了目标序列的可检测性，又保持了单核苷酸分辨能力。一个常微分方程模型可用于描述这一阈值行为，并为引物设计提供可预测的框架。基于这一原理，我们开发出了用于一锅法诊断的热力学编码分子编程技术（TEMPO），该技术可在30分钟内实现阿托摩尔级灵敏度，还能在单步微流控操作中同时完成与测序结果一致的SNP基因分型及病原体检测。