抗PD-1联合抗CTLA-4阻断通过增强CD8+ T细胞应答和促进三级淋巴结构形成克服非小细胞肺癌脑转移中的免疫排斥

《Nature Communications》：Anti-PD-1 plus anti-CTLA-4 blockade overcomes immune exclusion in NSCLC brain metastases by enhancing CD8+ T cell responses and promoting tertiary lymphoid structure formation

　　

非小细胞肺癌（NSCLC）的脑转移（BrMs）对抗PD-1单药治疗反应不佳，但其潜在的免疫抵抗机制尚未完全阐明。本研究中，研究人员整合了临床结局分析、配对人体组织分析和同源小鼠模型，以表征BrM免疫微环境。临床分析提示，与纳武单抗单药相比，纳武单抗联合伊匹木单抗可改善颅内疾病控制。配对人体标本显示，BrM较原发肿瘤含有更少的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和三级淋巴结构（TLSs），界定了一种免疫排斥表型。一个同源BrM模型重现了这一表型，并对抗PD-1单药治疗具有抵抗性，而联合抗PD-1和抗CTLA-4阻断可抑制肿瘤生长并延长生存期。单细胞RNA测序、流式细胞术和免疫荧光显示，联合治疗后CTL浸润和效应功能增加。CD8⁺ T细胞耗竭消除了治疗获益，联合治疗还扩增了滤泡辅助性T样（Tfh-like）细胞并诱导了TLS样结构。这些发现表明双重检查点阻断在NSCLC BrM中增强了适应性免疫应答。

**论文解读：抗PD-1联合抗CTLA-4阻断克服非小细胞肺癌脑转移的免疫排斥——基于临床与临床前模型的机制研究**

**研究背景与目的**

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要类型，约40%的患者在病程中发生脑转移（BrMs），严重影响预后和生活质量。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）已改善转移性NSCLC的总体生存，但抗PD-1单药治疗对活跃性BrM疗效有限。临床前研究在黑色素瘤BrM模型中提示，联合抗PD-1和抗CTLA-4可增强肿瘤控制，但NSCLC BrM中该联合方案的机制尚不明确。此外，BrM免疫微环境——尤其是细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和三级淋巴结构（TLSs）的状态——如何影响免疫治疗应答，仍缺乏系统研究。本研究旨在通过整合临床结局分析、配对人体组织转录组和蛋白水平分析，以及同源小鼠BrM模型，阐明NSCLC BrM免疫排斥的表型特征，并探索抗PD-1联合抗CTLA-4阻断克服这一排斥的机制。

**主要技术与方法**

研究人员采用了多平台整合策略：①临床队列：回顾性纳入京都大学医学院收治的接受纳武单抗单药（2016–2017年）或纳武单抗联合伊匹木单抗（2021–2024年）的NSCLC患者，分析颅内疾病控制率、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），并评估新发BrM累积发病率。②人体组织分析：利用公共转录组数据集（GSE161116和GSE248830）进行差异表达和基因集富集分析（GSEA）；对2008–2021年间手术切除的配对原发肿瘤与BrM石蜡标本进行免疫组化染色（CD8a、FOXP3、CD3、CD20等），量化CTL、调节性T细胞（Tregs）和TLS密度。③小鼠模型：通过颈内动脉（ICA）注射CMT167或LLC细胞株建立同源NSCLC BrM模型，并通过颅内直接注射联合皮下种植模型评估联合治疗对TLS形成的影响。免疫细胞表型分析采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术和免疫荧光。

**研究结果**

**1. 纳武单抗联合伊匹木单抗克服BrM对NSCLC患者预后的负性影响**
回顾性分析显示，基线存在BrM的患者接受纳武单抗单药治疗后PFS显著短于无BrM者（中位63 vs 77天，HR=1.65，P=0.025），而联合治疗组中BrM与非BrM患者PFS无显著差异（中位160 vs 113天，HR=1.24，P=0.63）。联合治疗组颅内疾病控制率呈升高趋势（32% vs 67%，P=0.174），新发BrM累积发病率呈降低趋势（2年累积发病率17.3% vs 3.7%，P=0.24）。在无驱动基因改变（主要为EGFR突变）的患者中，两组OS差异消失。

**2. 转录组分析揭示NSCLC BrM免疫微环境与原发性肿瘤不同**
公共转录组数据主成分分析显示BrM与原发肿瘤基因表达谱显著分离。基因集富集分析（GSEA）表明BrM中免疫应答、趋化因子信号通路以及TLS相关基因集显著下调。共识TME去卷积评分显示BrM中CD8⁺ T细胞、细胞毒性及Treg评分降低，而M2巨噬细胞评分无差异。趋化因子CCL19和CCL21在BrM中显著下调。

**3. 组织学证实NSCLC BrM中CTL浸润和TLS形成减少**
免疫组化定量分析显示，配对标本中BrM的CTL和Treg密度均显著低于原发肿瘤。高CTL浸润的BrM患者术后OS显著延长（多因素Cox分析，log-transformed连续变量P<0.05）。TLS密度在BrM中也显著降低，且TLS阳性BrM中CTL浸润更高，但TLS存在与术后生存无显著关联。

**4. 小鼠NSCLC BrM模型中联合治疗有效**
经ICA注射建立的同源BrM模型显示，抗PD-1或抗CTLA-4单药疗效有限，而联合治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存（与同型对照相比P<0.001），且不引起明显体重下降。在尾静脉注射的原发性肺癌模型中，单药即显示活性。

**5. scRNA-seq揭示联合治疗重塑BrM免疫微环境并增强CTL效应表型**
scRNA-seq显示联合治疗组中CD8⁺ T细胞比例增加，GO富集分析提示干扰素应答和细胞毒性通路上调。T细胞再聚类显示联合治疗富集效应记忆CD8⁺ T细胞（Tem）和Tpe（祖细胞耗竭）样细胞，同时CD4⁺Tfh（滤泡辅助性T细胞）样细胞比例呈升高趋势。

**6. 联合治疗增加BrM中CTL浸润和功能**
流式细胞术和免疫荧光验证了联合治疗后BrM中CD8⁺ T细胞比例升高，且其中Granzyme B（GzmB）阳性、PD-1阴性的效应细胞比例增加。CD8⁺ T细胞耗竭完全消除了联合治疗的抗肿瘤效果。

**7. 联合治疗促进Tfh细胞扩增和TLS样结构形成**
在颅内直接注射联合皮下种植的BrM模型中，联合治疗组部分应答小鼠的BrM中观察到由B220⁺ B细胞、CD3⁺ T细胞和CD11c⁺树突状细胞组成的密集免疫细胞聚集体，符合TLS样结构特征，而在同型对照和抗PD-1单药组中未发现。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，本研究的临床回顾性分析存在固有偏倚和样本量限制，且ICA注射模型可能同时模拟脑实质转移和软脑膜病变。尽管在CMT167模型中联合治疗与抗PD-1单药在生存期上未达统计学差异，但LLC模型显示显著差异，提示模型特异性。TLS样结构的功能成熟度尚待进一步确认。

研究结论：NSCLC BrM具有独特的免疫抑制微环境，特征为CTL和TLS密度低，这是抗PD-1单药疗效有限的重要原因。抗PD-1联合抗CTLA-4阻断在临床前模型中有效克服这一抵抗，其疗效关键依赖于增强CD8⁺ T细胞浸润和功能，并可能诱导TLS样结构。这些发现为在NSCLC BrM患者中进一步评估联合免疫治疗策略（特别是抗PD-1联合抗CTLA-4）提供了理论依据，并提示未来研究应聚焦于TLS诱导和免疫细胞归巢机制的深入探索。