从人类胰腺肿瘤和十二指肠中分离细菌和真菌

《Gut Microbes》：Isolation of Bacteria and Fungi from Human Pancreatic Tumors and Duodenum

　　

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）具有独特的肿瘤微生物组，使用抗生素/抗真菌混合物清除肠道细菌或真菌已被证明可以减少小鼠的胰腺肿瘤负担。然而，由于缺乏临床相关的微生物群，评估肿瘤相关微生物作用的功能研究很少。在这里，研究人员详细描述了一个从胰腺癌患者的十二指肠和肿瘤中分离细菌和真菌的有效工作流程，特别优化用于低温保存的低生物量样本。使用该工作流程，研究人员还从器官捐献者的正常胰腺组织和十二指肠中分离了微生物群，并通过16S和ITS测序分析确认了从组织样本中分离的细菌和真菌的存在。分离和测序结果显示了胰腺和十二指肠微生物组之间的明显相似性，并突出了在肿瘤微环境中存活的独特细菌菌株。作为概念验证，研究人员表征了一株从胰腺肿瘤中分离的选择性Klebsiella oxytoca菌株（UMKO1），使用全基因组测序、代谢组学和离体肿瘤培养来确定其对胰腺肿瘤微环境的潜在影响。总之，这个优化的工作流程允许从低生物量、低温保存的胰腺和十二指肠组织中分离多种细菌和真菌，然后可用于表征临床相关肿瘤相关微生物群的功能研究。

**论文解读：从人胰腺肿瘤和十二指肠中分离细菌与真菌——优化工作流程及对胰腺癌微生物组的初步功能探索**

**研究背景与问题**

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是美国最致命的恶性肿瘤之一，5年总生存率仅13%。其恶性程度高，部分原因是缺乏早期检测标志物且对现有化疗和免疫治疗耐药。近年来研究发现，PDAC肿瘤拥有独特的微生物组，与健康胰腺组织明显不同。多项研究在人和小鼠肿瘤中检测到细菌和真菌负荷增加，通过16S测序发现γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），特别是克雷伯菌属（Klebsiella）和肠杆菌属（Enterobacter）富集；ITS测序则发现子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为优势真菌。更重要的是，肿瘤微生物组的组成与患者临床预后相关：长期生存者的肿瘤微生物组多样性更高，富集芽孢杆菌属（Bacillus）、假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）等；而Malassezia globosa的存在则与较差生存和化疗反应不佳相关。在动物模型中，口服抗生素/抗真菌混合物清除肠道和肿瘤微生物会导致肿瘤负荷降低，而移植小鼠或人的粪便微生物群（Fecal microbiota transplant, FMT）可逆转这一表型。肠道和肿瘤微生物被认为通过免疫和代谢机制影响PDAC进展，例如γ-变形菌可代谢吉西他滨（Gemcitabine）导致耐药，微生物代谢产物（如色氨酸衍生物、三甲胺N-氧化物）可调节肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）中的免疫抑制或抗肿瘤免疫。

然而，目前功能研究面临两个核心障碍：第一，胰腺肿瘤中微生物生物量极低，难以获得可靠的宏基因组测序数据，限制了对肿瘤特异性微生物生物学行为的理解；第二，现有功能研究多依赖粪便微生物群移植或从其他来源分离的菌株，缺乏直接从PDAC患者肿瘤和肠道中分离的临床相关菌株。由于同一物种内不同菌株的毒力、致病性和定植能力差异巨大，必须使用从胰腺癌患者直接分离的微生物进行功能研究，才能揭示其促肿瘤机制。为此，研究人员开发并优化了一个从PDAC患者十二指肠和胰腺肿瘤中分离细菌和真菌的工作流程，并应用于器官捐献者的正常组织，同时对一株肿瘤分离的Klebsiella oxytoca菌株（UMKO1）进行了初步功能表征，以展示该流程在功能研究中的应用潜力。

**主要关键技术与方法**

样本来源：PDAC患者的肿瘤和相邻十二指肠组织采集自密歇根大学Rogel and Blondy胰腺癌中心（IRB批准）；健康捐献者胰腺和十二指肠组织来自Gift of Life Michigan器官捐献中心。组织立即冷冻保存（液氮速冻或冻存于RPMI培养基中，-80°C储存）。关键技术包括：①使用多种选择性培养基（如添加钙的BHI琼脂、改良哥伦比亚琼脂、GAM琼脂、Sabouraud琼脂、Leeming-Notman琼脂等）在缺氧（1.5%-3.5% H₂，N₂平衡）和低氧（2% O₂，5% CO₂，N₂平衡）条件下培养；②通过MALDI-TOF质谱或16S/ITS扩增子测序鉴定纯培养菌落；③对UMKO1进行全基因组测序（Oxford Nanopore技术）和组装；④将UMKO1在肿瘤间质液培养基（Tumor Interstitial Fluid Media, TIFM）中培养后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行靶向和非靶向代谢组学分析；⑤利用离体肿瘤培养系统（基于气-液界面模型），将小鼠原位PDAC肿瘤切片暴露于细菌上清，通过免疫荧光（CD8、颗粒酶B）评估T细胞功能；⑥进行小鼠原位移植瘤实验（C57BL/6J小鼠，抗生素处理后再以FMT或活菌UMKO1灌胃），并分析肿瘤重量；⑦通过荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）和细胞角蛋白免疫染色检测肿瘤组织中的克雷伯菌。

**研究结果**

**1. 从人胰腺肿瘤和十二指肠中分离细菌和真菌**
研究人员对6例PDAC患者（A-F）的十二指肠和肿瘤组织以及2例捐献者正常组织进行分离培养。在低氧和缺氧条件下，使用多种培养基，从肿瘤样本中成功分离到活菌（3例肿瘤中有2例获得分离物），而从十二指肠样本中获得更多菌落形成单位（CFU）和更丰富的物种多样性。分离菌株主要包括克雷伯菌属（K. variicola、K. oxytoca、K. pneumoniae、K. aerogenes）和肠球菌属（Enterococcus faecalis、E. faecium），其中克雷伯菌和芽孢杆菌属（Bacillus）同时从肿瘤和十二指肠中分离到，提示肿瘤相关微生物可能源自肠道。16S测序显示PDAC肿瘤中以假单胞菌门（Pseudomonadota，原变形菌门）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）为主要分类单元，与培养结果一致；FISH染色确认了克雷伯菌在PDAC肿瘤组织中的存在。ITS测序显示十二指肠和肿瘤中均存在担子菌门和子囊菌门，但未能培养出Malassezia globosa；从肿瘤中分离出一株未鉴定的丝状真菌（Thermoascus crustaceus）。结果表明该工作流程可成功从冷冻低生物量样本中分离多种细菌和真菌，且培养物与测序结果吻合。

**2. 从健康捐献者胰腺组织和十二指肠中分离细菌和真菌**
对2例捐献者的正常胰腺和十二指肠组织应用相同流程，发现十二指肠源CFU多于胰腺源。从捐献者G的十二指肠和胰腺中主要分离到铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和念珠菌（Candida），从捐献者H中分离到葡萄球菌（Staphylococcus）和芽孢杆菌。16S测序显示正常十二指肠同样以假单胞菌门和厚壁菌门（Bacillota）为主，但肠杆菌科丰度远低于PDAC肿瘤；ITS测序确认Candida的存在。研究人员注意到铜绿假单胞菌在培养板上过度生长且在水和背景对照中常见，故将其视为污染菌；同时，正常胰腺中分离的Cutibacterium acnes也被认为是皮肤污染的引入。与PDAC组织相比，正常胰腺组织产生更少的假单胞菌门分离物，支持PDAC与假单胞菌门（尤其是肠杆菌科）富集相关的假说。

**3. 肿瘤分离的Klebsiella oxytoca（UMKO1）的特征**
由于克雷伯菌在PDAC肿瘤分离物中最为常见，研究人员对从肿瘤中分离的UMKO1株进行了深入表征。全基因组测序确认其为Klebsiella oxytoca，基因组包含一个6.07 Mb的主染色体和一个173 kb的质粒。泛基因组分析发现UMKO1具有多个独特的基因簇，主要与代谢过程相关，包括谷氨酰胺转运（GlnQ）和谷胱甘肽转运（GsiA、GsiB、GsiD）。在模拟肿瘤间质液条件的TIFM培养基中培养后，非靶向代谢组学显示UMKO1消耗了多种氨基酸（色氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸等）以及α-酮戊二酸和柠檬酸，并产生多胺（腐胺）和丁酸。进一步靶向定量LC-MS/MS证实UMKO1通过色氨酸代谢产生吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid）、3-吲哚乙醇和犬尿酸（kynurenic acid），这些代谢物均为强效的芳烃受体（Aryl hydrocarbon receptor, AhR）激动剂，已知可重塑髓系细胞向免疫抑制表型。利用离体肿瘤培养系统，将小鼠PDAC肿瘤切片暴露于UMKO1及对照菌株（K. pneumoniae、K. variicola、E. coli K12）的上清中，免疫荧光结果显示，只有UMKO1上清显著减少了颗粒酶B阳性的CD8⁺T细胞比例，而总CD8⁺T细胞数量无差异，提示UMKO1产物可能抑制细胞毒性T细胞功能。在小鼠原位模型中，抗生素处理后再用活UMKO1灌胃的动物，其肿瘤重量（与体重之比）呈现增大趋势，虽未达统计学显著，但表明单菌株UMKO1可能部分足以产生促肿瘤效应。此外，UMKO1基因组编码胞苷脱氨酶（长版本），在TIFM中1小时内即可代谢吉西他滨使其失活，而其他非γ-变形菌（如粪肠球菌、藤黄微球菌）则不能。值得注意的是，UMKO1及克雷伯菌、E. coli在含吉西他滨的TIFM中仍能大量增殖，而藤黄微球菌和粪肠球菌生长受限，提示γ-变形菌可能特别适应营养贫乏且含化疗药物的TME。

**讨论总结与结论**

本研究的主要限制在于培养基组合无法覆盖全部低生物量肿瘤微生物组，分离物会因培养基选择而偏倚；样本量较小（3例PDAC肿瘤培养，10例肿瘤/十二指肠测序）且组织为冷冻保存，可能降低培养率。尽管如此，研究人员成功分离了其他研究中报道的PDAC微生物组常见菌种。研究结论（翻译原文）：总之，本研究提供了一个从低生物量样本中分离活细菌和真菌的详细工作流程，同时仔细识别分离过程中的任何污染物。对临床相关肿瘤分离株UMKO1的初步表征，揭示了其对肿瘤微环境的潜在促肿瘤影响。临床相关微生物群的分离将使得更多关于调节肿瘤微生物群的机制研究成为可能，阐明它们对胰腺癌发生的影响。