成年小鼠平滑肌细胞中膜型I基质金属蛋白酶的条件性敲除减轻动脉粥样硬化而不影响基本心血管功能

《Clinical and Translational Medicine》：Conditional knockout of membrane-type I matrix metalloproteinase in smooth muscle cells of adult mice alleviates atherosclerosis without affecting basic cardiovascular function

　　

背景：动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是全球发病率和死亡率的主要原因。尽管有效的降脂治疗已存在，但仍存在显著残余风险。在动脉粥样硬化中，血管平滑肌细胞（SMCs）发生去分化，促进疾病进展。膜型I基质金属蛋白酶（MT1-MMP/MMP14）促进SMC去分化。然而，抑制成年个体（尤其是已有动脉粥样硬化斑块者）中MMP14的效果尚不清楚。
方法：研究人员构建了一种可诱导的条件性SMC特异性MMP14敲除小鼠模型。分别利用超声心动图和线肌动描记法评估心脏和血管功能。在Ldlr^?/?小鼠（有或无MMP14缺陷）中评估动脉粥样硬化的进展和消退。对Ldlr^?/?小鼠的主动脉进行单核RNA测序（snRNA-seq），以确定对SMC群体的影响。
结果：与ASCVD患者冠状动脉的病理性内膜增厚相比，纤维粥样斑块内SMCs中的MMP14表达升高。成年小鼠SMC中MMP14的条件性敲除不改变血浆胆固醇水平或基本心脏和血管功能。然而，在缺乏SMC MMP14的Ldlr^?/?小鼠中，动脉粥样硬化发展减少，且现有斑块的消退增强。snRNA-seq显示，与Ldlr^?/?小鼠相比，MMP14缺陷的Ldlr^?/?小鼠中成纤维细胞样SMCs增加，泡沫细胞样SMCs减少。此外，SMC MMP14缺陷降低了SMC增殖和迁移，伴随着血小板衍生生长因子受体（PDGFR）β水平降低和PDGF信号减弱。
结论：SMC MMP14可能通过减弱PDGF信号并抑制SMC迁移和增殖，促进成年小鼠动脉粥样硬化。

**论文解读文章**

**研究背景、问题与研究意义**
动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是全球发病率和死亡率的主要原因。尽管他汀类药物和前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）抑制剂等降脂治疗能有效降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，但残余风险仍然显著。血管平滑肌细胞（SMCs）是动脉中膜的主要细胞，在正常生理条件下维持分化表型，但在动脉粥样硬化中，SMCs发生去分化，从收缩表型转为合成表型，导致增殖和迁移增加，并迁移至内膜形成泡沫细胞，促进疾病进展。膜型I基质金属蛋白酶（MT1-MMP/MMP14）是一种锌依赖性内肽酶，可降解细胞外基质（ECM）和非ECM成分，并作为信号蛋白发挥多种作用。前期研究表明，MMP14在动脉粥样硬化斑块中表达上调，且SMC中MMP14的组成性胚胎敲除可诱导动脉瘤形成并加重Apoe^?/?小鼠的动脉粥样硬化。然而，大多数需临床干预的ASCVD患者为已有动脉粥样硬化病变的成年人，抑制成年个体中MMP14对动脉粥样硬化的影响尚不清楚。因此，研究人员开展本研究，旨在探讨成年小鼠SMC中MMP14条件性敲除对动脉粥样硬化进展和消退的作用，并评估其对基础心血管功能的影响。该研究发表在《Clinical and Translational Medicine》。

**主要关键技术方法**
研究人员构建了可诱导的SMC特异性MMP14条件性敲除小鼠模型（Mmp14^flox/flox/Myh11-CreERT2），通过腹腔注射他莫昔芬诱导敲除。利用超声心动图和线肌动描记法评估心脏和血管功能。在Ldlr^?/?背景下，通过喂食西方饮食（WD）诱导动脉粥样硬化，并采用油红O染色、天狼猩红染色和免疫荧光评估斑块负荷和成分。单核RNA测序（snRNA-seq）分析主动脉组织以鉴定SMC亚群。人冠状动脉病变样本来源于12例缺血性心肌病患者和1例扩张型心肌病患者（不列颠哥伦比亚大学Bruce McManus心血管生物样本库）。原代SMCs分离自小鼠胸主动脉，通过Western blot、qRT-PCR、CCK-8增殖实验和Transwell迁移实验进行功能分析。

**研究结果**

**3.1 SMC特异性MMP14条件性敲除小鼠的表征**
通过免疫荧光染色，研究人员发现人冠状动脉纤维粥样斑块中SMCs（MYH11阳性细胞）的MMP14表达显著高于病理性内膜增厚，提示MMP14表达随疾病进展而升高。他莫昔芬诱导的Mmp14^SMC-CKO小鼠主动脉中Mmp14 mRNA和蛋白水平显著降低，而其他组织无明显变化，且敲除不影响体重、血糖和血浆脂质水平（除高密度脂蛋白胆固醇略有降低外）。

**3.2 成年小鼠SMC MMP14缺陷对基础心血管功能的影响**
通过线肌动描记法和压力肌动描记法评估，与对照组相比，Mmp14^SMC-CKO小鼠的胸主动脉和腹主动脉对高钾生理盐水溶液和苯肾上腺素的血管收缩反应、肠系膜动脉的周向应变和应力均无显著差异。超声心动图显示两组小鼠的心率、射血分数、缩短分数、心输出量和每搏输出量等心脏功能参数以及左心室质量、室间隔厚度、左心室后壁厚度和左心室内径等结构参数均无显著差异。因此，成年小鼠SMC中MMP14条件性敲除不影响基础心血管功能。

**3.3 SMC MMP14缺陷对动脉粥样硬化的影响**
在Ldlr^?/?背景下，他莫昔芬处理5天不影响血浆脂质水平和动脉粥样硬化发展。与对照组相比，Ldlr^?/?/Mmp14^SMC-CKO小鼠在WD喂养16周后主动脉弓和主动脉窦的斑块面积显著减小，且未观察到自发性动脉瘤形成。斑块中α-SMA阳性细胞减少，但胶原含量增加，而坏死核心面积、纤维帽厚度、SMC帽指数和CD68阳性细胞无显著差异。双因素方差分析证实他莫昔芬对动脉粥样硬化的影响是Cre依赖性的，即归因于SMC MMP14的条件性敲除。

**3.4 SMC MMP14缺陷对细胞群体的影响**
snRNA-seq分析显示，与Ldlr^?/?对照组相比，Ldlr^?/?/Mmp14^SMC-CKO小鼠主动脉中SMC亚群发生改变：泡沫细胞样SMCs比例降低，成纤维细胞样SMCs比例升高。成纤维细胞样SMCs富集于胶原合成和组织的通路，而泡沫细胞样SMCs富集于脂质摄取和代谢的通路。免疫荧光进一步验证了Ldlr^?/?/Mmp14^SMC-CKO小鼠斑块中I型胶原和纤连蛋白表达升高，而过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）和脂蛋白脂肪酶（LPL）表达降低。这些变化与斑块面积减小和胶原含量增加一致。

**3.5 SMC MMP14缺陷对SMC去分化的影响**
从Mmp14^SMC-CKO小鼠分离的原代SMCs中，收缩相关基因（Acta2、Tagln）和ECM合成相关基因（Col1a1、Col1a2、Col3a1、Fn1）的mRNA水平升高，提示MMP14缺陷促进胶原生成型SMC表型。CCK-8和Transwell实验显示MMP14缺陷显著降低原代SMCs和人类主动脉SMCs（HASMCs）的增殖和迁移。3D胶原凝胶培养中，对照组主动脉外植体周围出现明显的胶原降解区，而Mmp14^SMC-CKO外植体周围胶原几乎完整，表明MMP14是SMC降解胶原的关键酶。此外，MMP14缺陷的原代SMCs中低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）水平升高，血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）水平降低，PDGF-BB刺激后磷酸化ERK1/2水平减弱。然而，LRP1敲低不能挽救MMP14缺陷SMCs的增殖和迁移表型，表明LRP1并非MMP14调控SMC表型变化的关键介质。

**3.6 SMC MMP14缺陷对动脉粥样硬化消退的影响**
在动脉粥样硬化消退模型中，Ldlr^?/?/Mmp14^SMC-CKO小鼠在WD喂养12周后转变为普通饲料并给予他莫昔芬诱导敲除。6周后，与基线和Ldlr^?/?对照组相比，Ldlr^?/?/Mmp14^SMC-CKO小鼠主动脉窦和主动脉整体斑块面积显著减小，而Ldlr^?/?对照组仅显示减少趋势。两组胶原含量在消退后均增加，但无组间差异。因此，抑制SMC MMP14加速了已有斑块的消退。

**讨论与结论**
本研究证实，成年小鼠SMC中MMP14缺陷可减轻动脉粥样硬化并促进其消退，且不影响血浆脂质水平或基础心血管功能。与以往胚胎期SMC MMP14组成性敲除导致动脉瘤形成和动脉粥样硬化加重不同，本研究中条件性敲除未引起动脉瘤，表明敲除时机是关键因素。snRNA-seq揭示MMP14缺陷导致SMC亚群漂移，增加成纤维细胞样SMCs并减少泡沫细胞样SMCs，抑制SMC去分化、增殖和迁移，并减弱PDGF信号。MMP14同时作为胶原酶，其缺陷削弱了SMC的胶原降解能力，但增加了ECM合成基因表达，从而增加斑块胶原含量。结论：成年小鼠SMC中MMP14敲除不仅减少动脉粥样硬化发展，更重要的是加速现有斑块的消退，这对临床更具意义。研究人员指出，MMP14作为跨膜蛋白，可通过细胞特异性靶向（如纳米颗粒或GalNAc偶联技术）实现治疗性干预，可能为对现有治疗反应不佳的ASCVD患者提供新策略。