《Cancer Letters》：Talazoparib engages innate immune activation via PARP trapping–dependent cGAS/STING activation in Ewing Sarcoma
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Marianna Carrabotta|Maria Cristina Manara|Lorena Landuzzi|Elisa Simonetti|Andrea Nesca|Evelin Pellegrini|Margherita Maioli|Sofia Avnet|Franc
Marianna Carrabotta|Maria Cristina Manara|Lorena Landuzzi|Elisa Simonetti|Andrea Nesca|Evelin Pellegrini|Margherita Maioli|Sofia Avnet|Francesca Ruzzi|Francesca Salamanna|Marco Gambarotti|Pier-Luigi Lollini|Katia Scotlandi
意大利博洛尼亚IRCCS Rizzoli骨科研究所肿瘤学研究与功能基因组学实验室（ONCOGEN）
摘要
尽管有令人鼓舞的临床前数据，尤因肉瘤对聚ADP-核糖聚合酶抑制剂（PARPi）的临床反应仍十分有限。在本研究中，我们在PDX衍生细胞系和小鼠模型中比较了五种具有不同PARP捕获能力的PARPi。其中，捕获能力最强的塔拉佐帕里布的疗效明显优于奥拉帕里布或维利帕里布。它能够引发严重的DNA损伤、微核形成，并激活环GMP-AMP合成酶（cGAS）/干扰素基因刺激因子（STING）通路，从而促使I型干扰素和促炎细胞因子的释放，而这种效应在骨肉瘤中并未观察到。在体内，塔拉佐帕里布还能改变肿瘤微环境，增加巨噬细胞浸润并抑制肿瘤生长。在体外，经处理的尤因肉瘤细胞产生的条件培养基能促使M0型巨噬细胞向炎症性的M1型转变。这些免疫刺激效应是由肿瘤产生的干扰素引发的，在耐塔拉佐帕里布及经奥拉帕里布处理的尤因肉瘤细胞中则不存在，这凸显了PARPi的PARP捕获作用而非催化抑制作用的重要性。将塔拉佐帕里布与外源性的2′-3′-环GMP-AMP（cGAMP）联合使用时，与巨噬细胞共培养并不会进一步增强对尤因肉瘤细胞的吞噬作用，且在测试条件下也未观察到协同效应。因此，塔拉佐帕里布是一种具有先天免疫激活/巨噬细胞介导作用的强效细胞毒性药物，值得在该肿瘤类型中进行进一步临床评估。
引言
尤因肉瘤是一种侵袭性较强的儿童骨骼和软组织癌症，其主要致病原因是t（11; 22）（q24; q12）染色体易位，该易位会生成致癌融合蛋白EWSR1::FLI1（也称为EWS::FLI1）[1]。EWS::FLI1会改变尤因肉瘤的表观遗传特征，作为染色质状态的主调控因子，既能激活也能抑制增强子活性[2]。这种双重作用导致了肿瘤的侵袭性以及表型、分化能力和转移潜能的高度异质性。此外，EWS::FLI1还会影响DNA修复，并调节尤因肉瘤细胞的化疗敏感性。它会促进R环的形成——这类三链核酸结构会威胁基因组稳定性，同时通过占据乳腺癌基因（BRCA）1的位置来干扰同源重组（HR）DNA修复过程[3]。因此，尽管尤因肉瘤细胞中BRCA1表达水平较高且不存在突变[[4], [5], [6]]，但由于BRCA1被束缚在转录复合物中而无法应对DNA损伤，这类肿瘤仍被视为“BRCA缺陷型”肿瘤。BRCA1功能的受损正是尤因肉瘤细胞对依托泊苷等DNA损伤剂以及聚ADP-核糖聚合酶抑制剂（PARPi）高度敏感的原因[3]，而这些药物原本就是用于治疗存在同源重组缺陷（HRD）的BRCA1/2突变癌症以及具有“BRCAness”特征的肿瘤的，后者是指那些具有类似BRCA缺失的分子改变的肿瘤[7]。临床前研究一直表明，尤因肉瘤对PARPi，尤其是奥拉帕里布，具有很强的敏感性[8,9]，但临床试验却仅显示出有限的疗效，这主要是因为耐药性会迅速产生[[10], [11], [12], [13], [14]]。这一差异凸显出有必要更深入地了解该肿瘤环境中PARPi作用机制及耐药性的形成原因。
PARP1是PARP家族中研究最为广泛的成员，在DNA修复过程中起着核心作用。当它与DNA断裂处结合后，其催化活性就会被激活，进而导致染色质松弛，并招募能够协调后续修复过程的PAR结合蛋白。用小分子化合物抑制PARP1时，这些化合物大多是通过在催化位点与NAD+竞争来发挥作用[15]，这样一来就会损害DNA修复功能，导致DNA损伤积累。根据所用化合物的不同，这种抑制作用还可能促使PARP–DNA复合物滞留在损伤部位，进一步加剧基因组的不稳定性。此外，人们也越来越认识到PARP1及其抑制剂在DNA修复之外的其他功能，包括转录调控、核糖体生成、程序性细胞死亡以及肿瘤免疫调控[15,16]。尤其是PARP抑制与肿瘤免疫之间的关系仍然十分复杂且尚未被完全阐明。R环和DNA损伤可形成核膜较为脆弱的微核，这些微核容易破裂，使DNA释放到细胞质中，进而触发环GMP-AMP合成酶（cGAS）/干扰素基因刺激因子（STING）信号通路的激活[17,18]，同时也会促使信号转导和转录激活因子（STAT）1发生磷酸化并被激活[19]。这一信号级联反应会诱导I型干扰素（IFNs）和促炎细胞因子的产生，而这些因子又会进一步促进自然杀伤细胞（NK细胞）、细胞毒性T细胞以及巨噬细胞的募集[[20], [21], [22]]。然而，肿瘤细胞很少会自发产生I型干扰素[23]，这说明肿瘤细胞可能会抑制由STING介导的干扰素信号通路，以此逃避免疫系统的监视。尤因肉瘤通常属于“冷肿瘤”，其特征是突变负荷较低、T细胞浸润较少[24,25]，而髓系细胞浸润较多，其中包括具有免疫抑制作用的M0型和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）[[26], [27], [28]]。尤因肉瘤中M0型和M2型巨噬细胞比例较高与较差的预后相关[26,29]，这也为通过重新编程TAMs使其向炎症性的M1型表型转变提供了理论依据。在本研究中，我们探讨了PARPi在连接尤因肉瘤中的DNA损伤与先天免疫激活中的作用。我们研究了不同捕获能力的PARPi是否能够引发足以激活cGAS/STING通路的DNA损伤。研究结果表明，只有塔拉佐帕里布能够显著激活cGAS/STING通路，从而驱动I型干扰素信号的生成，并有效将肿瘤内的巨噬细胞从免疫抑制的M0/M2型状态重新编程为具有抗肿瘤作用的M1型表型。我们的研究结果表明，塔拉佐帕里布不仅能够作用于DNA修复，还能改变尤因肉瘤的肿瘤微环境，这也说明cGAS/STING信号通路的异常可能是导致对塔拉佐帕里布产生耐药性的原因。
章节节选
性别作为生物学变量
在我们的研究中，性别并非需要考虑的生物学变量。由于PARPi的疗效与性别无关，因此本研究仅针对雌性小鼠进行了实验。
尤因肉瘤细胞系
我们使用了以下来自人类患者的尤因肉瘤细胞系：TC-71（DSMZ，编号ACC-516）；通过转染pEGFP-N1质粒（Clontech）而稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的TC-EGFP细胞系[30]；A673细胞（CRL-1598?，ATCC）；以及患者来源的异种移植瘤细胞系EW#7-C、PDX-EW#5-C等。
在尤因肉瘤细胞中，PARPi的疗效与其PARP捕获能力相关
除了能够抑制PARP酶的催化活性外，不同的PARPi在将PARP1固定在DNA和染色质上的能力上也存在差异，其中塔拉佐帕里布的捕获能力最强，而维利帕里布的捕获能力最弱[[44], [45], [46]]。为了评估PARP捕获在尤因肉瘤中的作用，我们测试了五种临床常用的PARPi（塔拉佐帕里布、斯泰诺帕里布、帕米帕里布、奥拉帕里布和维利帕里布），并将它们应用于五种尤因肉瘤细胞系中，其中三种细胞系源自PDX模型。我们的研究结果表明，塔拉佐帕里布的效应最为显著
讨论
我们的研究表明，塔拉佐帕里布是治疗尤因肉瘤最有效的PARPi，同时还揭示了该药物在调节肿瘤与免疫系统相互作用方面的一个此前未被充分重视的作用机制。虽然PARPi最初是为了利用那些DNA修复功能有缺陷的肿瘤的合成致死性而研发的，但最新的研究发现表明，PARPi的疗效并不仅限于对PARP1的催化抑制作用，它们还能通过多种途径触发强烈的局部和全身性抗肿瘤免疫反应，涉及适应性免疫和先天免疫两大系统
资金来源
开展这项研究所获得的资金支持来自Fondazione AIRC per la ricerca sul cancro ETS，项目编号为IG2019–22805，资助对象为KS。
在撰写本文的过程中，作者们使用了ChatGPT-4来编辑文本、提升文本的清晰度和流畅度，并进行语法检查。在使用该工具/服务之后，作者们对内容进行了必要的审核和修改，並对本文的内容承担全部责任。
CRediT作者贡献说明
Marianna Carrabotta：概念构思、数据整理、定量分析、实验研究、结果可视化、初稿撰写、论文修订与润色。Maria Cristina Manara：数据整理、定量分析、实验研究、论文修订与润色。Lorena Landuzzi：数据整理、定量分析、实验研究、论文修订与润色。Elisa Simonetti：实验研究、论文修订与润色。Andrea Nesca：数据整理、实验研究、论文修订与润色。Evelin Pellegrini：
致谢
作者们要感谢以下机构为ES在博洛尼亚大学攻读博士学位提供的资金支持：Onlus il Pensatore ‘Matteo Amitrano’、Aurora Tomaselli, ricerca e prevenzione、Liberi di vivere、‘Luca Righi’、‘Chiara Paradiso’ – la forza dell'amore onlus、Associazione Mario Campanacci以及Associazione ‘Un sorriso con Luca’。我们还要感谢所有同意捐献样本、用于建立本研究所分析的PDX模型的患者、患者家属以及相关团队。
