《Analytical Biochemistry》：Development of Immunoassay Methods for Ricin and Application in the OPCW International Proficiency Test
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•优化并建立了 Western blot 和双抗体夹心 ELISA 免疫分析法，用于敏感地检测蓖麻毒素。•ELISA 方法显示出高灵敏度，检测限（LOD）为 1 ng/mL，且具有广泛的蓖麻毒素定量范围。•建立的方法实现了与官方 OPCW 测试数据一致准确的结果。引言蓖麻毒
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优化并建立了 Western blot 和双抗体夹心 ELISA 免疫分析法，用于敏感地检测蓖麻毒素。
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ELISA 方法显示出高灵敏度，检测限（LOD）为 1 ng/mL，且具有广泛的蓖麻毒素定量范围。
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建立的方法实现了与官方 OPCW 测试数据一致准确的结果。
引言
蓖麻毒素是一种来源于蓖麻豆（蓖麻油植物（Ricinus communis）的种子）的有毒蛋白[1], [2], [3]。它具有极高的毒性，真核细胞对其高度敏感——微克级剂量即可导致动物和人类中毒甚至死亡[4]。蓖麻毒素不仅仅是一种有毒蛋白，而是一种分子量为 60 到 65 kDa 的酶，具体分类为 II 型核糖体失活蛋白（RIP-Ⅱ）。RIP-Ⅱ（包括蓖麻毒素）是由两条多肽链（A 链和 B 链）通过单个链间二硫键连接而成的异二聚体全毒素[5], [6]。A 链（RTA, ～32 kDa）是一条有毒的多肽链，含有 N-糖苷酶的活性位点，可抑制蛋白质合成并导致细胞死亡[7]。B 链（RTB, ～34 kDa）是一条凝集素链，作为结合结构域起作用：它与目标细胞表面的糖蛋白或糖脂相互作用，促进 RTA 转运至细胞质[4], [8]。蓖麻毒素表现出极高的哺乳动物毒性；其小鼠腹腔内 LD50为 ～3.0 μg/kg，对应毒性比标准有机磷农药（如对硫磷）高 380 倍[9]。蓖麻凝集素（RCA120）是蓖麻产生的另一种 RIP-Ⅱ，与蓖麻毒素具有约 89% 的氨基酸序列同一性，并拥有与 RTA 相同的 N-糖苷酶活性[10]。然而，RCA120 是由两条 A 链和两条 B 链组成的四聚体（分子量 ～120 kDa），尽管其序列同源性高且酶活性相似，但其细胞毒性比蓖麻毒素低几个数量级（50-2000 倍）[11]。这种细胞毒性的差异主要归因于其 B 链的结构变化，这影响了细胞结合效率和细胞内运输效率。蓖麻植物广泛种植，蓖麻毒素具有极高毒性，粗毒素提取简单，且无特定解毒剂。由于这些原因，蓖麻毒素已被众多国家和机构作为候选生物战剂进行调查，构成了严重的生物恐怖主义和化学危害[1]。蓖麻毒素与多起涉及非法持有和企图部署的犯罪事件有关。臭名昭著的事件包括 1978 年保加利亚异见人士 Georgi Markov 被暗杀，以及后来 2014 年和 2020 年分别向美国前总统奥巴马和特朗普寄出含毒信件[12]。开发快速有效的检测方法对于保障国家安全和维持长期社会稳定具有重要意义 [6], [13]。
目前，蓖麻毒素的检测方法主要分为两类：基于免疫学的分析方法和基于质谱的检测方法[14]。常见的免疫学分析方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[15], [16]、Western blot（WB）和侧向流动层析测定（LFA），具有高灵敏度、强特异性和操作简便等优点[5]。此外，已开发出多种使用质谱的方法[17], [18]。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）具有一定的应用价值。然而，由于其灵敏度低，它不适用于复杂基质样品。此外，蓖麻毒素与其他蛋白质相似的分子量阻止了该技术实现准确和确定的鉴定结果[19], [20]。
对胰蛋白酶消化产生的蓖麻肽进行 HPLC-MS/MS（高效液相色谱串联三重四极杆质谱检测器）分析，提高了灵敏度和特异性[5], [21]。此外，蓖麻毒素的一级结构表现出品种特异性差异[13], [17], [22]，因此获得的胰蛋白酶片段严格依赖于品种。其他方法将 HPLC-MS/MS 与毒素的先前亲和捕获相结合。所有这些质谱方法都需要昂贵的仪器和复杂的样品预处理步骤，加上需要受过训练的人员来解释结果，使得普通实验室无法进行相关的检测工作。此外，与其他核糖体失活蛋白（RIPs）一样，蓖麻毒素可以通过基于其 N-β-糖苷酶活性的 Endo 试验（Endo assay）进行检测，这是一种使用尿素聚丙烯酰胺凝胶明确检测 RIPs 的既定方法。Endo 试验的一个显著局限性是它只能确认 RIPs 的存在，而不能特异性地鉴定蓖麻毒素，因为其他 RIPs（如 RCA120 和 abrin）也拥有 N-β-糖苷酶活性并能产生相同的特征 Endo 片段[23], [24]。大多数以前记录的蓖麻毒素免疫分析法采用独立的 ELISA 或 Western blot 格式，仅在简单缓冲液基质中验证，未适应 OPCW 验证任务中指定的复杂饮料和眼科基质，且很少有报告完成对官方未知能力测试样品的盲法性能评估。与这些仅限实验室的方法学研究不同，本研究建立了一个完全优化的双重免疫分析法流程，结合高灵敏度双抗体夹心 ELISA 定量筛选和分子量确认的 Western blot 鉴定，针对苹果汁和眼科液体复杂基质进行系统参数调优。更重要的是，本研究报告了在世界首次 OPCW 国际蓖麻毒素生物毒素能力测试（第二 Trial ToxPT 2025）上进行的完整盲样验证，提供了一套专门定制以满足官方化学武器验证评估标准的标准化、可复制的分析工作流，这构成了相对于现有蓖麻毒素免疫学检测方法的核心创新和实际进步。
禁止化学武器组织（OPCW）成立于 1997 年 5 月，致力于履行《化学武器公约》（CWC）的宗旨和目标，确保实施其所有规定，包括与验证缔约国遵守公约相关的规定 [8]。为了实现这一目标，OPCW 定期为成员国参与实验室组织不同类型的 能力测试，涵盖生物毒素样品、环境样品和生物医学样品，以确保每个成员国都拥有可靠的检测能力。由于具有高灵敏度、强特异性和操作简便等优点，OPCW 经常推荐 WB 和 ELISA 技术用于高分子量（HMW）生物毒素的检测[14]。双抗体夹心 ELISA 利用两种特异性抗体捕获目标毒素，进一步提高了检测的准确性和可靠性[25]。本研究详细介绍了 WB 和双抗体夹心 ELISA 方法用于蓖麻毒素检测的建立过程，并评估了它们在 OPCW 进行的第二 Trial ToxPT 中的应用性能。与之前的基于实验室的研究不同，本工作专门针对国际化学武器验证的实际评估需求。我们的工作不仅进一步规范了常规的蓖麻毒素分析工作流，还为 OPCW 附属实验室和生物毒素应急筛选提供了可靠、可复制且实际适用的参考策略。这项工作可以为全球毒素鉴定及相关国际协作验证任务提供一些有用的技术参考。
章节片段
材料与样品
蓖麻毒素参考标准品购自北京韩普药物与生物技术研究 院。商业蓖麻毒素参考标准品是从中国北部收集的工业品种 Ricinus communis 成熟种子中提取和纯化的。蓖麻毒素参考标准品以 A（～32 kDa）和 B（～33 kDa）链组成的二硫键桥接异二聚体形式存在，总分子量为 65 kDa。纯度经 SDS-PAGE 和尺寸排阻确认为 ≥ 98%
WB 检测方法的建立
图 1 显示了不同浓度蓖麻毒素的 WB 检测结果。在 55 kDa 和 70 kDa 的分子量之间出现逐渐清晰的条带。泳道 1 至 6 分别代表浓度为 1、2、4、6、8 和 10 μg/mL 的蓖麻毒素的 WB 结果。如图所示，对应 1 μg/mL 蓖麻毒素的泳道 1 未观察到条带，而对应 2 μg/mL 蓖麻毒素的泳道 2 可检测到目标蛋白条带。因此，这一结果表明
讨论
蓖麻毒素目前是《化学武器公约》（CWC）附表化学品中列出的唯一高分子量（HMW）蛋白毒素，因此成为 OPCW 生物毒素的关键验证目标之一。第二 Trial ToxPT 的模拟场景如下：“一个缔约国请求 OPCW 协助调查其部分公民涉嫌中毒事件。经过初步呕吐和非特异性流感相关症状（发烧、胸闷、咳嗽）后，一些受害者发展为
结论
综上所述，本研究建立了一个完全优化的双重免疫检测平台，由双抗体夹心 ELISA 和 Western blot 组成用于检测蓖麻毒素，并在世界首次 OPCW 蓖麻毒素 Trial 生物毒素能力测试（第二 Trial ToxPT, 2025）的官方盲样上系统验证了集成工作流。与以前报告的仅在简单实验室基质中验证的单格式蓖麻毒素免疫分析法不同，我们的核心创新体现在三个方面：（1）针对全
CRediT 作者贡献声明
Wenwen Xin: 监督，概念化。Shilei Liu: 监督，项目管理，资金获取。Xiujie Liu: 方法学，数据整理。Zhibin Su: 软件，方法学。Tao Zhang: 写作 – 审查与编辑，写作 – 初稿，项目管理，方法学。Zhongfang Xing: 项目管理，资金获取
利益冲突声明
? 作者声明，他们没有已知的可能被视为影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
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